不同辅助因子对CYP1A2和POR体外表达的影响

• 作 者: 陆慧媛 马骏 刘年 王守林
• 机 构: 南京医科大学公共卫生学院毒理学系现代毒理学教育部重点实验室,南京,210029
• 出 处: 中国毒理学会第五次全国学术大会
• 发表日期: 2009年8期
• 关键词: CYP1A2 POR Baculovirus/Sf9表达系统 辅助因子 体外表达

　　目的 研究在Baculovirus/Sf9系统中体外表达CYP1A2和POR蛋白时,不同辅助因子Hemin、5-ALA和Fe3+对表达效率及活性的影响,并尝试CYP1A2和POR的共表达,探寻稳定、高效表达高活性CYP1A2酶和POR的条件.方法 使用分子克隆技术构建含有CYP1A2和POR cDNA的重组质粒,并进行PCR和酶切验证；用该质粒转染昆虫细胞Sf9以获得含上述基因的杆状病毒.然后再进一步感染Sf9细胞,表达CYP1A2和POR蛋白.通过加入不同浓度5-ALA、Fe3+、Hemin或其组合,观察这些条件对蛋白表达水平和活力的影响.此外,将含CYP1A2或POR基因的杆状病毒按不同比例混合,联合感染Sf9细胞进行共表达.在此基础上,进一步分析5-ALA或(和)Fe3+对CYP1A2和POR共表达的影响,寻找最合适的体外表达条件.使用免疫印迹法检测蛋白质的表达情况；使用CO差示光谱法和细胞色素C还原法分别检测CYP1A2和POR的活性.结果 同时加入0.1mM 5-ALA和0.1mM Fe3+时,CYP1A2蛋白的表达显著提高,相对于单独加入5-ALA、Fe3+或Hemin,分别增加了40％、65％和32％；对于POR蛋白,加入了5-ALA和/或Fe3+后表达量显著提高,分别相当于不加任何辅助因子时的2.13、1.71和1.86倍,以仅加入5-ALA时表达水平最高；同样的结果也反映在POR的活力上,加入5-ALA和/或Fe3+分别提高7.1倍、4.5倍和5.4倍.在Baculovirus/Sf9系统中进行CYP1A2和POR共表达时,当病毒比例为2.5∶1或3∶1时,无论CYP1A2还是POR,其表达量都显著增加,分别比2∶1和4∶1时提高约50％,且两者的表达比例较为适当；在CYP1 A2∶ POR病毒比例为2.5∶1的表达体系中,加入0.1和0.35mM 5-ALA时,CYP1A2和POR的表达量都显著高于0.6mM；此外,加入0.1mM Fe3+时,蛋白表达也有较高水平；但有趣的是,当联合加入5-ALA和Fe3+时,蛋白的表达量反而下降,相关机制有待进一步研究.结论 不同辅助因子对CYP450和POR的表达及活性有明显影响.联合加入5-ALA和Fe3+可显著增加CYP450的表达和活性；低浓度5-ALA或Fe3+、以及CYP1A2和POR病毒比例为2.5∶1或3∶1时,有利于两者的共表达.