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目的:建立柱前手性衍生化-反相高效液相色谱法测定L-肌肽对映体的纯度。方法:以邻苯二甲醛/N-乙酰基-L-半胱氨酸(OPA/NAC)为手性衍生化试剂，反应生成具有荧光吸收的一对非时映异构体衍生物，采用C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流速1.0mL·min-1，50mmol·L-1醋酸铵缓冲溶液(pH6.0)-甲醇(70：30)流动相，柱温35℃，激发波长350nm，发射波长450 nm。结果:L-肌肽与其光学异构体分离度大于3，在0.104～2.68 mg·L-1范围内，D-肌肽衍生物色谱峰面积与其浓度呈良好线性关系，检测限浓度为0.02μg·mL-1。结论:建立的L-肌肤光学异构体杂质手性衍生化HPLC拆分检查法方便准确，可用于L-肌肤的光学纯度控制。