【摘 要】
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目的 利用TaqMan-MGB探针的实时荧光定量PCR方法,建立一种简便、快速,特异,灵敏的香港海鸥型菌检测方法.方法 根据香港海鸥型菌16S rDNA的保守区域设计特异性引物和探针.
【机 构】
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310005 杭州,浙江省疾病预防控制中心
【出 处】
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第六届传染病防控技术研究与应用技术论坛
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目的 利用TaqMan-MGB探针的实时荧光定量PCR方法,建立一种简便、快速,特异,灵敏的香港海鸥型菌检测方法.方法 根据香港海鸥型菌16S rDNA的保守区域设计特异性引物和探针.用不同浓度、不同温度对反应体系引物量、探针量及退火温度进行优化.用添加已知量的香港海鸥型菌样本验证方法敏感性；用香港海鸥型菌以及大肠杆菌、沙门菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌等致病菌验证方法特异性和稳定性.结果 当25μl反应体系中上、下游引物(10μM)各为0.6μl,探针(10μM)为0.4 μl,模板DNA量为5.0 μl,反应条件：预变性95℃ 20S,变性95℃10S,退火57 ℃ 40S,40个循环时,香港海鸥型菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR反应Ct值与待检菌浓度对数具有良好线性关系[Ct＝-3.538×log(菌浓度)+13.56,r＝0.999],方法的最低检测浓度达到36cfu/ml.23株香港海鸥型菌检测Ct值均小于35,而104株非香港海鸥型菌检测Ct值大于35或扩增曲线成一平滑直线.隔天连续5天重复试验Ct值变异系数小于3.20件活鲤鱼、18件活草鱼香港海鸥型菌检测率实时荧光PCR检测技术显著高于常规检测方法(P ＜0.01,χ2＝21.50).且后者所需时间为5d,前者仅需10 h.结论 TaqMan实时荧光定量PCR法是一种快速简便、特异性强、灵敏度高的香港海鸥型菌检测方法,值得推广应用.
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