论文部分内容阅读
目的：运用SYBR Green I荧光定量PCR技术建立一种实时定量检测猪细小病毒方法，
方法：本试验利用PCR技术扩增出猪细小病毒VP2保守区基因194 bp片段，并克隆到pGEM T载体上，以10倍梯度稀释纯化质粒为标准模板，进行SYBR Green I荧光定量PCR扩增并制作标准曲线，建立了猪细小病毒的荧光定量PCR检测方法。
结果：用双蒸水将标准样品10倍倍比稀释，用所建立的荧光定量PCR进行检测，发现在10个拷贝/μL时，仍有S型荧光曲线，说明该方法检测灵敏度可达1.0×102拷贝/μL;将猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪流感病毒、猪瘟病毒、猪乙型脑炎病毒、猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒阳性样品的DNA作为模板，进行荧光定量PCR检测，结果发现除PPV能够扩增出S型曲线，其它病毒均不能检测出S型曲线，与PBS扩增结果相似，低于基础线，表明所建立的方法具有较强的特异性;使用同一模板重复3次real—time PCR，3条S型曲线相似，实际所得的Ct值相同，表明此方法具有良好的重复性;将疑似患PPV仔猪组织病料10头份(编号为1～10)，阴性对照病料2头份(编号为11、12)提取DNA后，分别进行PCR和real-time PCR检测，结果显示，real—time PCR检测发现10份均为荧光定量PCR阳性，而常规PCR只能检测出7份阳性，表明real-time PCR检测灵敏度高于常规PCR。
结论：本试验所建立的SYBR Green实时定量PCR方法呈现出良好的S型扩增曲线，只出现扩增产物特异的单个峰，产物的T m值均一，说明没有引物二聚体及非特异性扩增产物出现;检测灵敏度可达10拷贝，具有很好的重复性。与常规PCR的比较，所建立的荧光定量PCR方法灵敏度高。该方法起始模板浓度与Ct值之间呈很好的线性关系，Ct值为14.9～32.0，标准曲线斜率为-0.32，相关系数r2为0.997，说明此反应体系具有很高的精确度和良好的稳定性。与常规PCR相比较，不但可以定性、定量检测PPV，而且能够检测出常规PCR无法检测的病料，同时也免去了DNA水平电泳的步骤，更加省时，且操作简单。因此，该方法具有快速、灵敏、特异、定性、定量等优点，可用于PPV感染的分子流行病学调查，同时也为研究PPV在猪体内感染过程及在体内分布规律，PPV早期诊断提供了新的技术手段。