【摘 要】
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[目的]分泌蛋白是寄生物与寄主互作过程中的重要功能因子,为研究稻瘟病菌活体寄生阶段特异的效应蛋白基因BAS1和BAS4的活体外功能与定位,获得大量的纯化蛋白,将其与mCherry融合并进行了原核表达试验。[方法]根据课题组前期PCR分析BAS1和BAS4在稻瘟病菌株中的多态性结果,选取有PCR扩增条带的菌株培养以提取总RNA,以反转录获得的cDNA为模板,PCR扩增获得BAS1和BAS4基因编码区
【机 构】
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农业生物多样性与病害控制教育部重点实验室,昆明650200
【出 处】
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第十七届中国农业生态与生态农业研讨会
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[目的]分泌蛋白是寄生物与寄主互作过程中的重要功能因子,为研究稻瘟病菌活体寄生阶段特异的效应蛋白基因BAS1和BAS4的活体外功能与定位,获得大量的纯化蛋白,将其与mCherry融合并进行了原核表达试验。[方法]根据课题组前期PCR分析BAS1和BAS4在稻瘟病菌株中的多态性结果,选取有PCR扩增条带的菌株培养以提取总RNA,以反转录获得的cDNA为模板,PCR扩增获得BAS1和BAS4基因编码区,以双元表达质粒pXY201为模板,PCR扩增获得mCherry基因,分别将目的片段BAS1、BAS4及mCherry克隆至pMD19-T载体,阳性重组子经双酶切后,分别将片段BAS1、BAS4与mCherry连接至pGEX-4T-1,并转化到大肠杆菌BL21中进行诱导表达。[结果]PCR扩增及测序结果表明BAS1、BAS4和mCherr大小分别约为348 bp、309 bp和711 bp,与预期大小一致。将PCR产物克隆连接到pMD(R)19-T载体,经双酶切回收目的片段后,分别将片段BAS1与mCherry以及BAS4与mCherry连接至pGEX-4T-1载体,并在BL21菌株中成功诱导表达,表达蛋白大小均约为60kDa,与预期值大小相符。[结论]本研究的开展为研究稻瘟病菌分泌型效应蛋白基因与mCherry融合的原核表达载体的构建,获得大量融合蛋白奠定了很好的实验基础,同时为进一步深入研究这些效应蛋白基因的亚细胞定位、功能及其与寄主的互作提供了试验材料。
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