【摘 要】
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棉花营养液漂浮育苗是一种全新的育苗技术,是由传统的旱生育苗环境转变到水生育苗环境的一种育苗方法.在这项技术的研究、应用及推广过程中,我们发现不同品种存在漂浮育苗适应性差异.iTRAQ(同位素相对标记与绝对定量技术)技术是一种新的定量蛋白质组学技术,相对传统的双向电泳技术及差异凝胶电泳技术,它具有定量更准确、重复性好、可同时标记4个样品的优势.利用棉花营养液漂浮育苗技术平台,通过全新的定量蛋白质组学
【机 构】
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湖南农业大学农学院,湖南 长沙 410128
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棉花营养液漂浮育苗是一种全新的育苗技术,是由传统的旱生育苗环境转变到水生育苗环境的一种育苗方法.在这项技术的研究、应用及推广过程中,我们发现不同品种存在漂浮育苗适应性差异.iTRAQ(同位素相对标记与绝对定量技术)技术是一种新的定量蛋白质组学技术,相对传统的双向电泳技术及差异凝胶电泳技术,它具有定量更准确、重复性好、可同时标记4个样品的优势.利用棉花营养液漂浮育苗技术平台,通过全新的定量蛋白质组学方法,鉴定棉花漂浮育苗适应能力相关的棉花耐涝渍基因,对棉花漂浮育苗技术的推广应用具有重要的理论与实践意义,能为培育漂浮育苗适应性强的品种提供理论依据,也能为棉花耐涝渍转基因育种奠定基础.
本研究首先对30个典型棉花品种的漂浮育苗适应能力进行了综合比较分析,筛选出漂浮育苗适应性强、弱的品种各1个.采用漂浮育苗、传统营养钵育苗两种育苗方式对两个品种进行育苗,苗期为3叶1心时,取其根系液氮速冻后放入-80℃冰箱中保存备用,采取丙酮沉淀法提取4个棉花材料根系蛋白质,用GE公司的2D quant kit进行蛋白定量,然后对蛋白质进行酶解,再用iTRAQ试剂标记肽段并进行等量混合,然后对混合后的肽段进行强阳离子交换色谱分离,再进行液相串联质谱鉴定.利用棉花转录组预测蛋白数据库和Mascot软件进行蛋白质鉴定,并依据蛋白丰度水平,当差异倍数达到1.5倍以上,且p-value值小于0.05时,视为差异蛋白.在此基础上,对鉴定到的差异表达蛋白进行GO分析、COG注释分析和Pathway代谢通路富集分析.
本项研究通过质谱共鉴定肽段62323个,蛋白1681个,所有肽段匹配误差控制在10 ppm以下,但由于棉花基因组序列测定工作2012年才完成,棉花基因组学研究相对滞后,功能已知蛋白数量不多,因此鉴定肽段序列覆盖率相对其他模式生物偏低,都仍然有超过30％肽段的覆盖率在10％以上.本研究鉴定到棉花其中大部分蛋白分子量在10-100KD,还有14％蛋白的分子量大于100KD,而这些大分子量蛋白通过双向电泳等常规蛋白质组学方法往往很难鉴定.
本研究依据蛋白丰度水平1.5倍这一定量差异阈值,共鉴定差异表达蛋白510个,对于这些鉴定的差异表达蛋白的GO功能注释分析结果表明,有大约25％的蛋白与代谢过程有关,有大约24％的与细胞过程相关,最重要的是,有大约12％的蛋白与细胞适应刺激反应有关.而就分子功能而言,有近50％的蛋白具有催化活性,44％的蛋白具有结合活性,说明鉴定的蛋白几乎都具有功能活性.本项研究对鉴定到的差异蛋白质和COG数据库进行了比对分析,预测这些蛋白质可能的功能并对其做功能分类统计,发现鉴定的差异蛋白大都可以归入能力代谢与转化、氨基酸运输与代谢、糖运输与代谢、翻译、核酸结构与功能、翻译后修饰、信号肽等类别.
本研究对所鉴定的差异蛋白还进行了Pathway代谢通路富集分析,共发现51个Pathway与棉花营养液漂浮育苗适应能力相关,比如有5个差异蛋白都涉及TCA cycle Pathway.
总之,经过上述生物信息学综合分析,基本确定了Subtilase family protein、alpha/beta-Hydrolases superfamily protein等6个与棉花水浮育苗适应性高度相关的棉花耐涝渍关键基因,目前正在进行表达验证及后续的功能分析.
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