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从分泌抗pthA核定位信号肽单克隆抗体的杂交瘤细胞株3D10H2中提取总RNA，采用RT-PCR，逆转录合成单链cDNA作为模板，用小鼠重链可变区和轻链可变区通用引物，克隆抗体可变区基因。在重链可变区和轻链可变区基因上加入部分互补的连接肽序列，通过重叠延伸PCR将两个可变区基因通过连接肽基因连接起来，构建抗pthA核定位信号肽单克隆抗体的单链抗体基因ScFv，克隆到pGEM-T载体和原核表达载体pET32a(+)中，通过酶切、PCR和测序进行鉴定，重组原核表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导重组蛋白的表达。试验结果显示，从杂交瘤细胞中提取的总RNA有3条带，基本无降解，通过RT-PCR成功地扩增出重链可变区基因和轻链可变区基因，基因片段大小位于300bp和400bp之问。采用重叠延伸PCR将两个可变区基因串联，获得的单链抗体基因大小约750bp，将其克隆到T载体和原核表达载体pET32a(+)，通过酶切和PCR鉴定均获得了约750bp大小的条带。测序结果显示，重链可变区基因有360bp，轻链可变区基因有342bp，中间连接肽基因45bp，经过IPTG诱导ScFv原核表达，获得了大小为44.5kD的ScFv重组蛋白。试验成功构建了抗pthA核定位信号肽单克隆抗体单链抗体基因并实现了抗体基因在原核中的表达。