【摘 要】
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SWI/SNF复合物是一种ATP依赖的染色质重塑复合物,其多个亚基失活与肿瘤密切相关。相对于突变频繁,起抑癌基因作用且目前研究较多的几个核心亚基,我们发现没有或很少发生突变的DPF2可变亚基可能充当着原癌基因的角色,然而对其功能及机理知之甚少。为了深入探讨染色质重塑复合物亚基DPF2在肿瘤发生发展中的作用及其可能的分子机制,我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在人胰腺癌细胞PANC-1中敲除
【机 构】
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宁夏医科大学基础医学院,银川,750004 宁夏医科大学医学科学研究所,银川,750004
【出 处】
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中国生物化学与分子生物学会2016年全国学术会议
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SWI/SNF复合物是一种ATP依赖的染色质重塑复合物,其多个亚基失活与肿瘤密切相关。相对于突变频繁,起抑癌基因作用且目前研究较多的几个核心亚基,我们发现没有或很少发生突变的DPF2可变亚基可能充当着原癌基因的角色,然而对其功能及机理知之甚少。为了深入探讨染色质重塑复合物亚基DPF2在肿瘤发生发展中的作用及其可能的分子机制,我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在人胰腺癌细胞PANC-1中敲除DPF2基因。首先我们在DPF2 基因第4 外显子两侧内含子区设计了两对特异性sgRNA,以pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin 质粒为骨架载体,构建了两对用于在细胞内表达sgRNA 的重组真核表达质粒。为了最大限度地降低脱靶效应,本实验我们选用pST1374–N–NLS–flag–linker-Cas9-D10A 切口酶配合我们构建的这两对sgRNA表达质粒一起使用,共同电转化至肿瘤细胞中,使用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选,挑取单克隆细胞进行培养,提取细胞基因组DNA,最后,经过PCR扩增、测序等方法鉴定敲除效果,确定成功敲除了包括整个第四外显子在内的398bp的DNA片段,成功构建了DPF2 基因敲除肿瘤细胞株。
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