论文部分内容阅读
目的 最近研究发现,血小板上的TLR4 受体在肿瘤的转移中发挥着重要的作用,在刺激因素的作用下可以激活血小板表面的TLR4 受体,促进血小板粘附至肿瘤细胞表面,进而促进肿瘤细胞的转移。课题组前期研究也发现,LPS 刺激血小板后,TNF-α、MCP-1 的表达水平显著升高,提示LPS 可激活血小板TLR4 信号通路,诱导相关细胞因子的产生,调节相关生理功能。但是,这一现象的机制如何,仍值得进一步的研究。为此,我们计划以黑色素瘤细胞为研究对象,从TLR4 下游的MyD88 依赖及TRAM/TRIF 依赖信号通路着手,观察其在血小板TLR4 激活后的变化,同时观察下游MAPK、PI3K/Akt、NF-KB/IRF-3 及PTEN 的变化情况；炎症因子、趋化因子、黏附分子等细胞因子的改变；肿瘤转移密切相关的金属基质蛋白9(MMP-9)的表达情况,明确血小板TLR4 及相应信号通路在黑色素瘤细胞对血小板粘附的作用,为肿瘤转移的研究提供新的研究方向。方法 (1)设计并合成MyD88、TRAM siRNA 序列,脂质体法转染血小板,构建MyD88、TRAM 的表达抑制的细胞模型；(2)采用HMGB1 刺激血小板,流式细胞术、激光共聚焦显微镜观察干扰前后血小板TLR4 表达的变化情况；(3)QRT-PCR、ELISA 法检测干扰前后,炎症细胞因子TNF-α、IL-6,趋化因子MCP-1、MIP1-β,CD44 及基质金属蛋白MMP-9 的表达变化情况；(4)QRT-PCR、Western Blot 法检测干扰前后MAPK、NF-KB 及PTEN 的表达变化情况；(5)CFSE 标记血小板,与人恶性黑色素瘤细胞株A375、MV14 细胞共培养,通过激光共聚焦显微镜观察干扰前后黑色素瘤细胞对血小板粘附情况的变化。结果 (1)HMGB1 刺激后,血小板TLR4 表达显著增加；同时TNF-α、IL-6、MCP-1、MIP1-β,CD44及MMP-9 的表达也显著增加。(2)siRNA 干扰可显著抑制MyD88、TRAM 的表达,MyD88、TRAM 表达抑制的细胞模型中,TNF-α、IL-6、MCP-1、MIP1-β,CD44 及MMP-9 的表达显著降低。(3)激光共聚焦结果 显示血小板MyD88、TRAM 表达抑制后,黑色素瘤细胞对血小板的粘附显著减少。(4)血小板MyD88、TRAM 表达抑制后,MAPK、NF-KB、PTEN 的表达显著降低。结论 血小板TLR4 下游信号通路MyD88、TRAM 在血小板与黑色素瘤细胞的粘附中发挥着十分重要的作用,其作用机制可能是血小板经肿瘤细胞分泌的HMGB1 刺激后,TLR4 信号通路被激活,通过MyD88、TRAM 活化转录因子MAPK、NF-KB、PTEN,导致炎症因子及趋化因子的表达的改变,进而改变影响血小板与黑色素瘤细胞的粘附,影响其转移。研究结果 有望为肿瘤转移的研究提供新的研究方向。