【摘 要】
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目的：从耐药胶质瘤C6/ADR细胞中克隆多药耐药基因启动子(Pmdr1),构建Pmdr1控制的双自杀基因表达载体,并初步研究其在C6/ADR中的表达情况.方法：取对数生长期C6/ADR细胞,提取基因
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目的：从耐药胶质瘤C6/ADR细胞中克隆多药耐药基因启动子(Pmdr1),构建Pmdr1控制的双自杀基因表达载体,并初步研究其在C6/ADR中的表达情况.方法：取对数生长期C6/ADR细胞,提取基因组DNA,利用引物PCR扩增Pmdr1,克隆入T载体,利用NdeI/HindⅢ双酶切反应,用Pmdr1置换pcDNA3.TK中的CMV启动子,获得pcDNA3.Pmdr1.TK,酶切及测序鉴定;BamHI酶切pcDNA3.Pmdr1.TK及pcDNA3.CD.TK,将pcDNA3.CD.TK中的CD基因插入到pcDNA3.Pmdr1.TK中TK基因的上游,获得pcDNA3.Pmdr1.CD.TK,酶切及测序鉴定;在脂质体介导下将pcDNA3.Pmdr1.CD.TK转染C6和C6/ADR细胞,500ug/mlG418筛选获得稳定转染细胞株,PCR鉴定自杀基因在两种细胞中的整合情况,RT-PCR鉴定表达情况.结果：C6/ADR细胞生长良好,PCR成功扩增出260bp的Pmdr1并克隆入T载体后,经分子克隆技术将Pmdr1成功插入pcDNA3.TK中,通过酶切和测序证实插入长度和序列正确,形成pcDNA3.Pmdr1.TK;BamHI酶切pcDNA3.CD.TK后获得CD基因,通过基因重组技术成功将其插入同样酶切后的pcDNA3.Pmdr1.TK质粒TK基因的上游,PCR及测序证实插入CD基因的大小、位置及方向正确,形成pcDNA3.Pmdr1.CD.TK;脂质体法将质粒成功稳定转染入C6和C6/ADR细胞,PCR证实自杀基因在两种细胞中都有整合,RT-PCR显示自杀基因仅在耐药细胞株C6/ADR中得到了表达.结论：成功建立了Pmdr1调控的双自杀基因表达系统,并证实其在耐药胶质瘤细胞可特异性表达.
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