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ClosTron系统所采用的技术是基于乳酸乳球菌LtrB基因来源的二类内含子的靶向基因操作技术,这一技术具有较高的可操作性和较好的基因定向效率,已经广泛的应用于梭菌的基因敲除研究中。到目前为止,已报道的解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum )相关的基因敲除工作都是基于ClosTron系统完成的。然而,由于targetron质粒在解纤维梭菌中的丢失效率极低,再加上ClosTron本身的技术限制,有可能造成条件基因失活,从而大大降低突变位点的稳定性,此外,由于质粒不相容性的存在,无法丢失的质粒也严重阻碍了连续的基因敲除的开展。本研究致力于通过构建基于pyrF的筛选工具优化ClosTron系统,提高解纤维梭菌中质粒丢失效率,从而实现基因的靶向连续敲除。该筛选工具包括一个通过同源重组删除染色体上的pyrF基因构建的底盘细胞H10ΔpyrF 和一个带有PyrF表达框和红霉素抗性基因的targetron质粒,其工作原理是利用红霉素进行正筛获得目标突变株,再利用5-氟乳清酸(5-FOA)进行反筛,实现突变株中targetron质粒的丢失。解纤维梭菌以其较完善的遗传操作系统和较简单的纤维小体结构,被认为是优选的研究纤维小体结构、组装和功能的分析平台。已知CipA(脚架蛋白)和Cel48F(外切纤维素酶)是解纤维梭菌纤维小体中重要的组成部分,并在纤维素降解过程中发挥重要作用。利用这一筛选工具,我们成功实现了cipC和cel48F的失活,构建了双突变株H10ΔpyrFΔcipC和H10ΔpyrFΔcel48F,并实现了质粒的快速丢失,并在表型水平及转录水平分析基因敲除的影响。之后,我们以质粒丢失的H10ΔpyrFΔcel48F为底盘细胞又构建了三突变株H10ΔpyrFΔcipCΔcel48F,从而实现了基因的连续敲除。因此,本研究构建的基于pyrF的筛选工具能够通过促进质粒的快速丢失,实现靶向基因的连续敲除,从而提高ClosTron系统在解纤维梭菌中应用的效率和稳定性,这为今后以解纤维梭菌为遗传操作平台的纤维小体以及整合生物加工技术(CBP)生物转化相关的研究提供了技术支持。通过构建基于pyrF的筛选工具优化ClosTron系统以实现解纤维梭菌中的基因连续靶向敲除