论文部分内容阅读
目的 探讨慢病毒介导RNA干扰(RNAi)抑制APP695基因表达对体外培养的APP695转基因小鼠皮质神经元细胞分泌β淀粉样蛋白(Aβ)的影响.方法 构建靶向APP695基因的短发夹状RNA(shRNA)慢病毒表达质粒(pFU-GW-iRNA),进行酶切和测序鉴定.慢病毒表达质粒与包装质粒(pHelper 1.0和Helper 2.0)共转染293T细胞,获得病毒浓缩液并测定滴度.使用APP695-shRNA慢病毒载体感染体外培养的APP695转基因小鼠皮质神经元,设定为慢病毒介导阳性干扰(APP695-RNAi)组,另设阴性对照病毒感染(NC)组、未经病毒感染(CON)组.采用实时荧光定量PCR检测APP695基因mRNA的表达,Western印迹检测APP695蛋白的表达,采用Elisa检测Aβ40和Aβ42的生成.结果 PCR扩增和测序结果证实,APP695 shRNA核苷酸链序列插入正确,包装慢病毒产生病毒悬液的滴度为5×108 TU/ml.使用慢病毒载体感染体外培养的APP695转基因小鼠皮质神经元,实时荧光定量PCR检测APP695-RNAi组APP695基因mRNA的抑制率为76.70%,与NC组和CON组相比差异有统计学意义(P＜0.001).Western印迹结果显示蛋白水平表达下降与定量PCR一致.Elisa检测干扰72 h后APP695-RNAi组、NC组、CON组Aβ40的分泌分别为(184±15)ng/L、(647±30)ng/L、(656±40)ng/L.APP695-RNAi组与NC组和CON比较差异均有统计学意义(均为P＜0.001);APP695-RNAi组、NC组、CON组Aβ42的分泌分别为(19.2±1.9)ng/L、(67.6±6.0)ng/L、(68.6±7.0)ng/L.APP695-RNAi组与NC组和CON比较差异均有统计学意义(均为P＜0.001).结论 慢病毒载体介导的APP695基因RNA干扰可以有效抑制痴呆小鼠皮质神经元细胞Aβ40和Aβ42的分泌.