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猪圆环病毒病((Porcine circovirus disease, PCVD)主要是由猪圆环病毒2型(Porcine circovirus2, PCV2)引起的猪传染性疾病,自1991年在加拿大首次报道以来,至今世界各地已广泛传播。由于PCV2能致感染仔猪的免疫抑制,给全世界养猪业带来了巨大的损失。2008年第20届国际猪病大会上,人们已将PCVD列为当前危害养猪业发展的头号疾病。PCV2感染的主要特征是外周血和免疫器官淋巴细胞的大量缺失及单核细胞的浸润,也是其致感染仔猪免疫抑制的基础。对于PCV2致淋巴细胞缺失的机制至今尚有争论,有的研究表明是由于淋巴细胞凋亡引起的,有的则提出反对意见。本试验在我们课题组以前研究的基础上,通过体内外试验,研究PCV2导致淋巴细胞缺失的机制及其主要信号途径。离体试验：选用5头猪圆环病毒2型及猪呼吸和繁殖综合征病毒(PRRSV)抗体阴性普通断奶仔猪,无菌分离脾脏淋巴细胞和巨噬细胞(Mφ),分别以PCV2和PCV2+Mφ与淋巴细胞相互作用,同时设Mφ和空白对照组。培养0、6、12、24h后分别收取各组淋巴细胞,用流式细胞术对细胞凋亡率进行测定,半定量RT-PCR法测定淋巴细胞Fas和FasL mRNA的转录情况,放射免疫法检测cAMP和cGMP浓度。结果：PCV2+Mcp组的淋巴细胞凋亡率在24h时显著高于其他3组(p<0.05)；6h时,PCV2+Mcp组淋巴细胞的Fas mRNA转录量显著高于空白对照组(p<0.05),24h时显著高于其他3组(p<0.05); FasL mRNA的转录变化与Fas mRNA基本一致。PCV2对细胞内cAMP和cGMP浓度影响不大,而Mφ在6h时能显著下调cAMP和cGMP浓度和cAMP/cGMP比例(p<0.05),12h时下调cGMP浓度(p<0.05),上调cAMP和cGMP比例(p<0.05)24h时上调cGMP浓度(p<0.05),但下调cAMP/cGMP比例(p<0.05)。相关性分析表明,淋巴细胞凋亡率和Fas/FasLmRNA的转录呈显著正相关(分别为：Fas,p=0.000, r=0.606; FasL,p=0.000, r=0.579).表明PCV2能诱导体外培养淋巴细胞的凋亡,且巨噬细胞能协同PCV2诱导淋巴细胞的凋亡,这种细胞凋亡的发生与Fas/FasL系统有关。为进一步探讨在仔猪体内PCV2诱导淋巴细胞凋亡的情况及其机制,首先复制了PCVD动物模型。方法：选取19头ELISA检测PCV2抗体阴性及PCR检测PCV2病原阴性的5周龄健康断奶仔猪,随机分为对照组4头和攻毒组15头。攻毒猪每头滴鼻4mLPCV2病毒悬液并辅以佐剂刺激,对照组攻等量PCV2阴性的PK15细胞悬液。攻毒后每天观察其临床症状和测定直肠温度,并分别于0,14,21,35d扑杀。取血液分离血清,进行PCV2. PRRSV和PRV抗体滴度(ELISA法),PCV2核酸(PCR法),血清细胞色素C(ELISA法)浓度的检测；取肺脏、心脏、肝脏、肾脏、脾脏、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结和支气管淋巴结等,观察肉眼和组织病理变化。结果：所有攻毒猪均出现病毒血症。组织病理学变化,在21d时最为严重,主要以出血性问质性肺炎,淋巴组织淋巴细胞缺失及巨噬细胞和嗜酸性粒细胞浸润,肝炎及肾炎为特征。血清PCV2抗体及细胞色素C浓度均随着攻毒时间的延长而显著升高,并且两者呈显著正相关。结论：成功复制出了猪圆环病毒病动物模型,且血清细胞色素C可以作为PCVD病程发展的重要监测指标。在成功复制的PCVD模型上,选取病变最严重的两个外周免疫器官：腹股沟淋巴结和脾脏,探讨在PCV2感染过程中诱导淋巴细胞凋亡的动态变化及其主要凋亡途径。方法：取腹股沟淋巴结和脾脏,流式细胞术检测细胞凋亡率；荧光定量RT-PCR检测Fas/FasL及bcl-2/bax mRNA表达量；分光光度法检测caspase-3, caspase-8和caspase-9的活性；荧光分光光度法检测细胞内Ca2+浓度,孔雀绿比色滴定盒检测Ca2+-ATP酶的活性,荧光定量RT-PCR检测钙/钙调素依赖性磷酸激酶II mRNA相对表达量；放射免疫法检测cAMP和cGMP浓度。同时检测血清中sFas/sFasL浓度的变化。腹股沟淋巴结试验结果：(1)细胞凋亡率：三个实验组仔猪腹股沟淋巴结的细胞凋亡率均显著高于对照组(P<0.01),并且攻毒后14d的凋亡率最高。(2)FasL mRNA水平,攻毒后21d显著高于对照组(p<0.05),Fas mRNA表达,攻毒后35d显著低于对照组(p<0.05)。(3)6cl-2和bax mRNA表达量及bax/bcl-2比值：bax mRNA表达量及bax/bcl-2比值均在14d时显著上调(p<0.05)。(4)caspase活性：caspase-3和caspase-8活性变化趋势一致,均在攻毒后21d显著高于对照组(p<0.05),其他时间与对照组相比差异不显著(p>0.05),caspase-9的活性变化不大(p>0.05)。(5)细胞内[Ca2+]和Ca2+-ATP酶活性：三个攻毒组腹股沟淋巴结细胞内[Ca2+]均显著高于对照组(p<0.01),并且21d时最高；Ca2+-ATP酶活性,21d时显著下调(p<0.05)；CaMK Ⅱ mRNA表达量在整个实验过程中变化不大。(6)cAMP和cGMP含量的变化：cGMP浓度在攻毒后21d时显著下降(p<0.05),而cAMP浓度变化不大,但三个攻毒组cAMP/cGMP比值均显著高于对照组(p<0.05)。脾脏试验结果：(1)脾脏细胞凋亡率,三个实验组均显著高于对照组(p<0.01),并且14d的凋亡率最高；(2)FasL mRNA水平,在攻毒后21d显著高于对照组(p<0.05),35d时极显著高于对照组(p<0.01)；Fas mRNA35d时的表达量显著低于对照组(P<0.05)；(3)bax mRNA的表达量,相比对照组14d时显著下降,35d时极显著升高(P<0.01),bax/bcl-2比值,14d和21d时比对照组显著下调(p<0.05)；(4)caspase-3和caspase-8活性,攻毒后均逐渐升高,三个攻毒组均极显著高于对照组(p<0.01)；caspase-9活性,相比对照组21d时极显著上升(p<0.01),35d时略有下降,但仍然显著高于对照组(p<0.05)；(5)细胞内Ca2+浓度,三个攻毒组均显著高于对照组(p<0.01),并且随着攻毒时间的延长逐渐升高；Ca2+-ATP酶活性在21d和35d时显著下降(p<0.05)；(6)CaMKⅡ mRNA表达量35d时相比对照组显著上调(p<0.05)；(7)cAMP浓度,三个攻毒组均比对照组显著下调(p<0.05),cAMP/cGMP比值,三个攻毒组相比对照组在21d和35d时均显著下调(p<0.05)。以上结果表明：(1)PCV2可以诱导体外培养脾脏淋巴细胞的凋亡,巨噬细胞可协同PCV2诱导体外培养淋巴细胞的凋亡,这种淋巴细胞的凋亡与Fas/FasL系统有关。(2)血清细胞色素C可以作为PCVD病程发展及预后的重要监测指标。(3)Fas/FasL途径在人工感染PCV2病毒仔猪脾脏和腹股沟淋巴结淋巴细胞凋亡中起着重要的作用。(4)PCV2介导脾脏和淋巴结淋巴细胞凋亡与胞内Ca2+浓度升高有关。