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盐度作为重要的海水理化指标对三疣梭子蟹的生长存活都有较大的影响,三疣梭子蟹作为中国沿海主要的养殖经济蟹类之一,盐度对三疣梭子蟹的影响一直备受关注,生物体为调节外界渗透压变化,通过转录来调节一些代谢物来维持渗透压的稳定。甲基化作为DNA的表观修饰可以通过甲基的去留来调节基因的表达,转录的影响在盐度调节中研究较多,而DNA的甲基化调节在渗透压中的研究较少。本文研究了长期(30d)低盐(12)养殖下的三疣梭子蟹其鳃上的甲基化变化位点,转录组差异及其代谢产物进行差异检测以期从DNA-RNA-代谢产物全面的阐述其低盐适应性的调控机制。其主要结果如下: 我们通过长期低盐养殖发现低盐胁迫对其生长及存活造成了显著影响,低盐组的生长率及存活率显著低于对照组(p<0.05),其血清中的钠、钾及氯等主要离子的含量都低于正常,长期低盐下其渗透压显著低于对照组,其鳃丝形态发生变化,但其对低盐的耐性增强。这些一系列的生理生化及形态上与其对低盐的适应性有关。 通过高通量测序我们从转录组中共获得可注释基因33606条,其中具有显著差异表达的基因1324条(p<0.05),包括显著下调的基因624条,显著上调的基因700条(对照比低盐),通过KEGG富集差异通路,发现能量代谢的通路在低盐组中显著下调,在低盐中显著上调的通路包括了大量的信号通路、氨基酸代谢通路及DNA修复通路。说明信号通路、氨基酸代谢及DNA修复在盐度胁迫中具有重要作用。我们通过定量发现BER通路(MBD4,APE1)及ALKBH2在盐度胁迫下的DNA的去甲基化调节具有重要作用。 采用基于NMR的代谢组学技术,共检测到梭子蟹鳃中的优势代谢产物30种,其中长期低盐胁迫导致差异显著的代谢产物有11种,含量显著(p<0.05)降低的有缬氨酸、蛋氨酸、谷氨酸和甘氨酸,含量显著(p<0.05)上升的有组氨酸、组胺、AMP、葫芦巴碱、三甲胺、延胡索酸和2-吡啶甲醇。这些代谢物变化与相应代谢通途的代谢酶基因表达水平都表明长期低盐胁迫可能主要影响了三疣梭子蟹鳃的渗透调节和能量代谢,可能最终会影响梭子蟹的正常生长。其中葫芦巴碱作为低盐耐性的特异代谢标记物。 通过Methy-Rad技术,检测到了89624个DNA甲基化位点,以差异转录组为模板,对获得的位点进行注释,其总共获得1656个可注释位点,主要差异甲基化位点集中生化过程(BP)中,差异的过程中主要集中在DNA的修复上,对其启动区域进行预测一共发现了差异的启动子区序列272段。其中的部分位点进行MS-HRM验证发现,V-ATP酶、NADP转氢酶、氢氯离子转运子等基因的甲基化位点在两组中存在差异。其中V-ATP酶、NADP转氢酶属于氧化磷酸化中的质子供体,通过转移质子以调节体内的离子平衡。V-ATP酶、NADP转氢酶及氢氯离子转运子上的甲基化标记在其盐度胁迫下发生明显变化表明其可作为低盐适应性的表观遗传标记。其中NADP转氢酶甲基化位点在性腺中也出现了显著差异,表明其可以作为低盐度耐受能力的选育分子标记。 阳离子调节中的质子通路在盐度适应性中起到了重要作用,本研究发现,在具有阴离子调节作用的氯离子通道上,氢氯离子转运子的压力控制型通道及GABA的配体控制型的氯离子在渗透压调节中也起一定作用。并且发现GABAB型受体在长期适应过程中发挥了重要作用。