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第一章生物信息学筛选卵巢癌多药耐药相关的单核苷酸多态性目的:采用生物信息学的方法筛选卵巢癌多药耐药相关的单核苷酸多态性。方法:利用GEO数据库卵巢癌顺铂耐药芯片(GSE45553)和多药耐药芯片(GSE73935)分别寻找卵巢癌顺铂耐药和多药耐药的关键生物学通路。再利用TCGA数据库下载卵巢癌突变数据,dbSNP数据库注释和SNPs多药耐药差异分析,SNPs靶基因PPI蛋白互作网络分析和SNPs功能预测,发现与卵巢癌多药耐药相关的功能SNPs。结果:癌症中的蛋白多糖,MAPK,粘着斑,PI3K-AKT等通路与卵巢癌顺铂耐药有关,其中EGFR,ITGA5,ERBB3,LAMA1,LAMB3,TGFB2,NFKB2等基因表达下调,BRCA1,TIMP3,CYFIP2,ANK3,MEF2C等基因表达上调。质膜(质膜蛋白,质膜整合蛋白)和代谢(蛋白代谢,细胞代谢)通路与乱卵巢癌多药耐药有关。在紫杉醇耐药细胞系中,观察到ABCB1,EPHA7和RUNDC3B基因的上调表达,LIPG,MCTP1,NSBP1,PCDH9,PTPRK和SEMA3A基因的下调表达。在多柔比星耐药细胞系中,ABCB1,ABCB4和IFI16基因的上调表达。TCGA筛选了70个SNPs,SNPs目的基因的PPI蛋白网络分析显示LDH1A2,POLR2H,TRIM4,CDC20,VPRBP,CETN2,HSPA8,UGHG1,DDB1和PI4KA等显著突变基因与卵巢癌多药耐药有关,TCGA预后分析观察到ALDH1A2(p=0.011),CETN2(p=0.027),ERBB2(p=0.019),TRIM4(p=0.019)与总生存有关,UGHG1(p=0.023)与无瘤生存有关。SNPs基于亚洲人群GWAS的功能预测显示出5个SNPs,即IGHG1/rs1042782(C>T),ORM2/rs2636890(G>A),POU6F2/rs7786697(T>C),LIPG/rs9958734(T>C)和CENT2/rs230118(C>A),但结果不理想。需通过后续对显著突变基因和SNPs的连锁不平衡分析或生物学实验进行功能的预测和验证。结论:代谢通路在卵巢癌多药耐药中扮演着重要角色,LDH1A2,POLR2H,TRIM4,CDC20,VPRBP,CETN2,HSPA8,UGHG1,DDB1和PI4KA等显著突变基因,以及5个位点IGHG1/rs1042782(C>T),ORM2/rs2636890(G>A),POU6F2/rs7786697(T>C),LIPG/rs9958734(T>C)和CENT2/rs230118(C>A)与卵巢癌多药耐药相关。第二章应用RGS双荧光载体对LIPG/rs9958734&VPS13A/rs7034531进行碱基置换目的:spCas9-NG和x Cas9(3.7)在RGS双荧光替代性报告载体引导下对靶位点LIPG/rs9958734和VPS13A/rs7034531在HEK 293T细胞系中编辑效率分析,实现对后期A2780细胞系靶位点的高效突变,得到A2780突变株方便后续实验。方法:使用罗氏转染试剂按h Cas9:lgRNA:reporter=1:1:0.5将RGS双荧光替代性报告载体分别与sp Cas9-NG和x Cas9(3.7)组合转染至HEK293T细胞系,48h后荧光显微镜拍照和流式上机分析转染效率。再将最高效率的组合转染至A2780细胞系并进行单克隆培养,最后PCR测序鉴定单克隆细胞系。结果:LIPG/rs9958734在spCas9-NG和x Cas9(3.7)组合中的编辑效果较高,VPS13A/rs7034531在sp Cas9-NG和x Cas9(3.7)组合中的编辑效果较低。sp Cas9-NG+lg LIPG-1+RGS+e GFP组合的编辑效果可最高达53.3%,而x Cas9(3.7)+sg VPS13A-1+RGS+e GFP组合的编辑效率较sp Cas9-NG+g VPS1-3A+RGS+e GFP组合高,但最高仅达15.9%。x Cas9(3.7)的编辑效率高于sp Cas9-NG,尤其体现出对非经典PAM ACG,GCG和TTG的高效剪切。将sp Cas9-NG+lg LIPG-1+RGS+e GFP和x Cas9(3.7)+sg VPS13A-1+RGS+e GFP分别转染至A2780细胞系,PCR测序鉴定LIPG突变成功且效率达25%,VPS13A突变失败。结论:Cas9的变体sp Cas9-NG和x Cas9(3.7)具有高效碱基置换功能,但x Cas9(3.7)对非经典PAM的编辑效率高于sp Cas9-NG。A2780细胞系LIPG/rs9958734(CC→TT)成功获得突变(A2780 KI细胞株)。第三章LIPG和VPS13A与凋亡通路的Bax、Bcl2、Caspase-3、Caspase-8、PARP-1表达量的相关性分析目的:研究A2780和A2780 DDP细胞系顺铂干预后LIPG和VPS13A与凋亡通路关键基因Bax、Bcl2、Caspase-3、Caspase-8、PARP-1基因的m RNA和蛋白表达量的关系,分析LIPG和VPS13A是否参与顺铂诱导凋亡通路。方法:A2780和A2780 DDP细胞系分别在0μg/mL,1μg/mL,2μg/mL,4μg/m L和0μg/m L,3μg/m L,6μg/m L,12μg/m L的顺铂浓度干预48h后,应用Real-time RCR和Western-blot对LIPG、VPS13A、Bax、Bcl2、Caspase-3、Caspase-8和PARP-1的m RNA和蛋白表达量进行检测分析。结果:在A2780细胞系中,顺铂处理48h后LIPG mRNA表达量分别为1.00±0.11,2.47±0.27,3.53±0.20和2.04±0.11,差异具有统计学意义(p<0.05)。在A2780 DDP细胞系中,LIPG基因的m RNA表达量随着顺铂浓度递增而增多,分别为1.00±0.06,7.28±0.45,7.47±0.36和9.22±0.38,与Caspase-3,Bax和PRAP-1基因的m RNA表达量相关。在A2780和A2780DDP细胞系中VPS13A基因的m RNA表达量与顺铂干预浓度没有统计学意义。在A2780和A2780DDP细胞系中,顺铂处理48h后LIPG和VPS13A基因的蛋白表达量随着顺铂梯度而明显改变。但是当顺铂浓度分别为4μg/m L和6μg/m L时,LIPG和VPS13A基因的蛋白表达量下降。LIPG和VPS13A基因的蛋白表达量与Bax,Caspase-3基因的蛋白表达量相关。相较与A2780细胞系,LIPG的m RNA和蛋白表达量在A2780 DDP细胞系中明显增加,差异具有统计学意义(p<0.05);而VPS13A的蛋白表达量在A2780 DDP细胞系中明显增加,差异具有统计学意义(p<0.05)。结论:LIPG作为脂质代谢基因参与顺铂诱导凋亡通路。同样,VPS13A编码的Chorein蛋白作为抗凋亡因子与卵巢癌顺铂耐药有关。第四章LIPG/rs9958734(T>C)突变型通过诱导S期阻滞和凋亡协同抑制卵巢癌细胞的增殖,迁移,侵袭和逆转多药耐药目的:研究A2780 KI细胞系(LIPG/rs9958734-野生型TT)和A2780细胞系(LIPG/rs9958734-突变型CC)在顺铂干预后的肿瘤生物学行为上的差异,寻找LIPG/rs9958734逆转卵巢癌多药耐药机制。方法:采用CCK8法,Transwell法,划痕法,Annexin-V-7-ADD双染色法,PI染色法分别对A2780 KI细胞系(LIPG/rs9958734-野生型TT)和A2780(LIPG/rs9958734-突变型CC)细胞系进行0μg/m L,1μg/m L,2μg/m L和4μg/m L浓度的顺铂干预下的细胞增殖,侵袭,转移,划痕,周期和凋亡实验。结果:相较于A2780细胞系,A2780 KI细胞系对顺铂的抵抗性增强。A2780 KI细胞系的生长速率较慢,但是1μg/m L,2μg/m L和4μg/m L的顺铂浓度干预48h后,A2780和A2780 KI细胞系的抑制率分别为11.23±1.48,26.36±2.76,35.53±2.16和8.73±0.96,20.60±3.48,28.84±2.97,A2780和A2780 KI细胞系的抑制率存在显著差异,具有统计学意义(p<0.05)。顺铂可以抑制A2780和A2780 KI细胞系的迁移和侵袭能力(p<0.05),且随着顺铂浓度的提高,抑制作用越明显。在0μg/m L,1μg/m L,2μg/m L和4μg/m L的顺铂浓度干预下,迁移实验中A2780和A2780 KI细胞系的小室细胞计数分别为225.9±9.061,158.9±7.187,95.9±13.153,72.8±2.936和257.3±10.275,170.5±7.412,139.5±5.720,100.3±10.253。侵袭实验中A2780和A2780 KI细胞系的小室细胞计数分别为281.5±9.889,68.2±6.653,46.2±5.116,41.9±3.695和351.7±19.202,106.4±5.473,80.2±6.426和53.1±5.840。划痕实验中,在0μg/m L,1μg/m L,2μg/m L和4μg/m L的顺铂浓度干预24h后,A2780细胞系的迁移率分别为A2780 KI细胞系的81.40%,87.31%,90.73%和78.24%。顺铂作用下,A2780 KI细胞系的迁移和侵袭能力都较A2780细胞系强,差异有统计学意义(p<0.05)。A2780和A2780 KI细胞系凋亡率分别为4.15%,7.60%,8.48%,13.77%和2.60%,3.99%,7.22%,10.19%。A2780和A2780 KI细胞系S期比率分别为16.15±2.1,20.28±1.6,25.04±1.2,29.7±3.5和13.61±3.5,16.64±6.2,19.71±4.1,16.69±2.3。A2780细胞系较A2780 KI细胞系凋亡率和S期比率显著增大,具有统计学意义(p<0.05)。结论:在顺铂作用下,A2780 KI细胞系的增殖,迁移和侵袭能力较A2780细胞系强,另一方面,A2780细胞系较A2780 KI细胞系易发生凋亡和S期阻滞。这也意味着LIPG/rs9958734突变型在顺铂压力下往往通过诱导S期阻滞和凋亡协同抑制卵巢癌细胞的增殖,迁移和侵袭。更为重要的是,LIPG/rs9958734突变型有着更好的顺铂敏感性。因此,LIPG/rs9958734突变型可作为潜在的预测和逆转卵巢癌多药耐药表型的分子标志物。