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蛇毒磷脂酶A2 (Snake venom phospholipase A2,svPLA2)是蛇毒中毒性最强的组分,除具有酶活性外,还可能具有多种毒理学活性,具有潜在的利用价值。同一种毒蛇的蛇毒中可能存在多种PLA2,虽然它们的氨基酸序列和空间结构相似,一级结构差异不大,但功能上却差异明显,因此是研究蛋白质结构和功能的极好模型,也是蛇毒研究领域的一个热点。中介蝮(Gloydius intermedius)为蝰科蝮亚科(Crotalinae)毒蛇,广泛分布于我国西北、华北地区,是我国6种蝮蛇中毒性最强的一种,其PLA2的结构及作用的分子机制有待阐明,而分离获得PLA2是解决这些问题的前提。本研究的内容及结果：1.中介蝮蛇毒PLA2的分离纯化(1)以中介蝮粗毒为原料,用Sephacryl-200HR凝胶过滤层析柱进行初步分离,用50mmol/L醋酸铵缓冲液洗脱,分离得到8个蛋白峰(Peak1-8)。以获得的峰组分1mL腹腔注射昆明小鼠,观察急性毒性效应,并采用SDS-PAGE分析组分的蛋白纯度。结果表明,Peak1和Peak8蛋白含量甚微,无致死活性。Peak2、Peak6和Peak7虽然有小鼠致死活性,但是没有引起偏瘫和呼吸衰竭,而且有出血,推测可能为出血毒素。Peak3、Peak4、Peak5有致死活性,且能引起偏瘫及呼吸衰竭,可能为神经毒素。SDS-PAGE分析发现这3个组分都非单一条带,因此需要进一步分离。(2)用HiTrap Q阴离子交换层析对具有神经毒性的Peak3、4、5进一步的分离纯化,上样后以A液(50 mmol/L醋酸铵缓冲液,pH7.8)洗脱未结合的组分,之后从A液到100%B液(50mmol/L醋酸铵缓冲液,0.5mol/L NaCl pH7.8)进行线性梯度洗脱。收集各洗脱峰及穿透峰,然后取各组分1mL腹腔注射昆明小鼠,根据急性毒性结果判定神经毒素活性,用SDS-PAGE分析组分纯度。结果表明,Peak3-1、Peak4-1和Peak5-2有致死活性,且局部有出血,其可能为出血毒素。Peak3-2、Peak4-2、Peak5-1均有致死活性,且可导致偏瘫及呼吸衰竭,为神经毒素,由于SDS-PAGE分析发现不是单一条带。(3)最后,利用HiTrap SP|阳离子交换柱对有PLA2神经毒活性的3个峰组分(Peak 3-2、Peak 4-2、Peak1 5-1)进行了分离,上样后以A液(50 mmol/L醋酸铵缓冲液,pH5.5)为起始洗脱液,之后从A液到100% B液(50 mmol/L醋酸铵缓冲液,0.5mol/L NaCl pH5.5)进行线性梯度洗脱,收集各洗脱峰。腹腔注射昆明小鼠,观察急性毒性效应,同步用SDS-PAGE分析组分纯度,卵磷脂琼脂平板法检测致死毒性组分的PLA2活性。结果表明,Peak3-2-2、Peak4-2-1、Peak4-2-2和Peak5-1-2无致死活性,Peak3-2-1和Peak5-1-1均有致死活性,Peak3-2-1分子量在14kDa左右,纯度接近单一条带,Peak5-1-1仍有三个条带,不纯。Peak3-2-1、Peak5-1-1都具有磷脂酶A2活性,其中Peak3-2-1的PLA2活性最高。2.生物活性初步检测：(1)酶活性检测：以中介蝮蛇粗毒做阳性对照,卵磷脂琼脂平板法检测了Peak3-2-1组分的PLA2酶活性,结果显示Peak3-2-1比粗毒的透明圈大。(2)抑菌活性检测：以大肠杆菌为对象,粗毒为阳性对照,PBS为阴性对照,检测Peak3-2-1组分的24h抑菌效应,粗毒组出现的抑菌圈明显,而Peak3-2-1组分的抑菌活性不高。(3)溶血活性检测：以粗毒为阳性对照,红细胞血红蛋白释放法测定毒素的溶血活性,发现Peak3-2-1组分可以引起溶血,但活性比粗毒低。(4)以SD大鼠的膈神经-肌肉接头标本为模型,电生理学方法检测了Peak3-2-1的突触阻断效应,发现Peak3-2-1 20min后就可以抑制间接刺激诱发的膈肌收缩,60 min后膈肌收缩下降到只有正常幅度的10%左右。而且Peak3-2-1对间接刺激诱发的大鼠膈肌收缩有抑制作用,但不影响直接刺激膈肌引起的肌肉收缩,说明它抑制的是神经-肌肉接头的传递,而对肌肉组织本身无明显影响,其作用部位在突触间隙,因此属于神经毒素。结论：采用凝胶过滤层析和离子交换层析技术,从中介蝮蛇粗毒中筛选分离得到了一种具有神经毒性的PLA2,其分子量大约为14 kDa,该PLA2具有溶血活性、无抑菌活性。本工作为下一步研究中介蝮PLA2的分子进化及作用机理奠定了基础。