铜绿假单胞菌芳香硫酸酯酶突变体库的构建与筛选

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铜绿假单胞菌芳香硫酸酯酶(Pseudomonas aeruginosa arylsulfatase,PAAS)是生化制药工具酶及潜在免疫分析标记酶,可与碱性磷酸酶配对应用于SDESA-ELISA。然而野生型PAAS催化活性低,对其进行酶分子工程改造是提高催化活性的有效策略。课题组前期建立了基于双酶融合表达测定酶突变体相对标签酶活性比值的突变体库高通量筛选方法。该方法用于PAAS突变体库筛选时,通过构建ECAP-PAAS融合表达蛋白,以大肠杆菌碱性磷酸酶(Escherichia coli alkaline phosphatase,ECAP)为标签酶,PAAS为目标酶,采用光度法单通道双酶同测(SDESA)测定PAAS/突变体与ECAP的活力比值作为筛选指标。分别以碱裂解与超声裂解对M72位突变体制备粗酶液并测定活力比值。两种裂解方法所得粗酶液活力比值无明显统计学差异,因此选取适合高通量筛选体系的碱裂解制备粗酶液。通过测定大肠杆菌细胞裂解液中ECAP的本底表达确定筛选阈值;当ECAP活力≥0.0053 kU/L时,认为双酶融合表达蛋白表达成功。双酶融合表达联合48孔板培养、碱裂解、96孔板酶标仪实施SDESA测定双酶活性比值,可实现对PAAS突变体库的全流程高通量筛选。为验证双酶融合表达高通量筛选体系所得活力比值筛选突变体库及解析序列-活性关系的可靠性,以免疫比浊法(ITA)测定未融合表达突变体的表观比活为参考,对双酶融合表达高通量筛选方法所得突变体的活力比值作相关性分析;结果显示,两种方法的结果高度一致。基于双酶融合表达测定相对标签酶活性比值的高通量筛选体系适用于快速筛选PAAS突变体库及解析其序列-活性关系。迭代饱和突变是蛋白酶分子改造的高效策略。PAAS中来自C51的甲酰基(DDZ)是公认的催化残基,选取位于PAAS底物进入活性中心通道上且侧链与DDZ相距较近的部分残基R55/M72/G138/D317/K375作为候选突变位点进行迭代饱和突变。分别用针对PAAS目的位点的随机引物(NNN)、精确引物等量混合物及单个精确引物,进行全质粒PCR扩增构建定点饱和突变体库。结果显示,用随机引物PCR对M72位定点饱和突变有明显密码子偏好性,筛选超600个单克隆仅获得10种预期突变体;精确引物等量混合物对M72位实施定点饱和突变,筛选不超过190个克隆成功获得19种预期突变体;单个精确引物对M72位逐个PCR实施定点饱和突变,仅各筛选2个单克隆就获得19种预期突变体。可见,精确引物实施定点突变所获饱和突变体库完整,需筛选的单克隆数较少,总耗时和总成本较低。因此,基于双酶融合表达测定酶活性相对值进行高通量筛选时,可选择精确引物等量混合物用于全质粒PCR扩增实施定点饱和突变以快速发现高活性突变体;当筛选工作量很大或需解析对应位点的序列活性关系时,选择单个精确引物逐个PCR对候选位点实施定点饱和突变更实用。用单个精确引物逐个PCR及双酶融合表达测定酶活性相对值对R55/M72/G138/D317/K375逐个实施饱和突变并进行高通量筛选,但未发现高活力突变体。可能这些位点不适于作为迭代饱和突变实施分子改造的候选突变位点,或只有协同突变才能提高其催化效力。综上所述,若仅需筛选高活力PAAS突变体,用精确引物等量混合物实施PCR联合双酶融合表达测定突变体活性对标签酶的比值高通量筛选,更有优势;若需要同步解析所选位点的序列-活性关系,则用单个精确引物逐个PCR联合双酶融合表达高通量筛选更合适。
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