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目的：利用基因工程和分子生物学技术,改造aac(3)-Ⅰ基因;同时克隆和表达temll6-aac(3)-Ⅱ融合基因,并对融合蛋白的活性进行了初步研究,为新型"抗生素伴侣"的开发研究打下基础.
方法：
1.aac(3)-Ⅰ基因的克隆和原核表达采用PCR方法,以临床耐药菌(耐氨基糖苷类抗生素)提质粒为模板,扩增aac(3)-Ⅰ基因片段.将该片段重组到表达载体pET28aa,构建pET28-aac(3)-Ⅰ原核表达载体,再将重组质粒转入感受态细胞E.coli BL21(DE3)中,用0.5mmol/L IPTG诱导,测定宿主菌pET28-aac(3)-I/BL21对多种氨基糖苷类抗生素的MIC,SDS-PAGE电泳分析表达产物.
2.运用易错PCR技术,体外对aac(3)-Ⅰ基因进行改构以常规PCR方法扩增到的产物为模板,进行易错PCR扩增,双酶切后重组到表达载体pET28aqh,构建pET28-aac(3)-Ⅰ表达质粒,再将重组质粒转入感受态细胞E.coli BL21(DE3)中,用0.5mmol/L IPTG诱导,测定宿主菌pET28-aac(3)-Ⅰ/BL21和pET28-aac(3).I/BE21对多种氨基糖苷类抗生素的MIC.
3.TEMll6-AAC(3)-Ⅱ融合蛋白原核表达载体的构建以pMDl8-T-<,tern116-aac>(3)-Ⅱ质粒(由陈接根硕士构建)为模板PCR扩增tem<,116-aac>(3)-Ⅱ融合基因,构建pET28-tem<,116-aac(3)-Ⅱ表达载体,经限制性内切酶双酶切和测序验证后,将该表达载体转化感受态细胞E.coli BL21(DE3),IPTG诱导融合蛋白表达,SDS-PAGE电泳分析表达产物.
4.融合蛋白TEM<,116->AAC(3)-Ⅱ的表达及活性初步研究摸索融合蛋白TEM<,116->AAC(3)一Ⅱ在E.coli BL21(DE3)中的表达条件,如诱导温度、诱导剂的浓度和诱导时间等.分析表达产物以及分布,确定纯化的策略和方法.初步分析融合酶的活性.
结果：
1.aac(3)-Ⅰ基因在pET28a质粒中的表达经测序证明成功构建AAC(3)-Ⅰ蛋白的原核表达载体pET28-aac(3)-Ⅰ质粒,诱导前和诱导后宿主菌E.coliBL21(DE3)对多种氨基糖苷类抗生素的MIC有明显增加,表明AAC(3)-Ⅰ蛋白有温州1医学院颂Ij学位论文耐药酶活性.SDS-PAGE电泳分析,分子量为17 kDa,与预期相符.
2.运用易错PCR技术,体外对aac例一I基因进行改构改构后筛选到一个克隆,测序发现7处碱基变异,分别是T 78 C、A l 56 G、A 267 G、C 272 T、C 357T、T 373 C、C 375 T.其中2处变异引起了相应氨基酸的变化,分别是272位C-T～11373位T-C,氨基酸由Ser 91 Phe;Tyr 125 His.O.5mmol/L IPTG诱导,以琼脂稀释法检测宿主菌pET28-aac(3)一I/BL21～11pET28-aac(3)一I瞻L21的MIC.实验结果表明变异株MIC较突变前下降64倍(庆大霉素)、8倍(依替米星)、4倍(阿米卡星).
3.TEMll6-AAC(3).II融合蛋白原核表达载体的构建成功构建TEMll6-AAC(3)-II融合蛋白的原核表达载体pET28-ternll6-aac(3).II,在E.coliBL2 1(DE3)细胞中呈部分可溶性表达,SDS.PAGE电泳分析,融合蛋白分子量64kDa,与预期相符.
4.融合蛋白TEMll6-AACO)-.II的表达及活性初步研究初步分析:0.5mmol/L IPTG、25℃诱导,TEMll6.AAC(3).II融合蛋白的表达量较多.TEMll6.AAC(3).II具有双重酶活性.