鼠血管平滑肌细胞转人cd59基因的实验研究.pdf

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编号:20181206152029429124    类型:共享资源    大小:121.35KB    格式:PDF    上传时间:2019-02-16
  
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关 键 词:
鼠血管平滑肌 人CD59基因 转基因
资源描述:
鼠 血 管 平 滑 肌 细 胞 转 人 C?D?5?9? 基 因 的 实 验 研 究 满 国 彤 , 张 同 琳 , 周 孝 思 ( 北 京 大 学 第 三 医 院 普 外 科 , 北 京 l?0?0?0?8?5?) [ 关 键 词 ] 肌 , 平 滑 , 血 管 ; 移 植 物 排 斥 ; C?D?5?9? 蛋 白 ; 移 植 , 异 种 [ 摘 要 ] 目 的 : 在 培 养 的 鼠 主 动 脉 平 滑 肌 细 胞 膜 上 表 达 人 C?D?5?9? 蛋 白 , 研 究 通 过 转 基 因 方 法 抑 制 异 种 移 植 超 急 性 排 斥 反 应 。 方 法 : 分 别 从 新 鲜 的 鼠 主 动 脉 和 人 脐 静 脉 分 离 培 养 鼠 主 动 脉 平 滑 肌 细 胞 、 人 脐 静 脉 内 皮 细 胞 , 并 用 免 疫 荧 光 和 免 疫 组 化 的 方 法 鉴 定 。 构 建 含 人 C?D?5?9?c?D?N?A? 的 真 核 细 胞 表 达 载 体 L?X?S?N?-?C?D?5?9?, 用 脂 质 体 转 染 法 将 L?X?S?N? 和 L?X?S?N?-?C?D?5?9? 转 化 进 鼠 主 动 脉 平 滑 肌 细 胞 , 4?0?0? ~? 8?0?0? m?g?· L?-? l?G?4?l?8? 筛 选 得 到 稳 定 转 化 子 。 流 式 细 胞 仪 筛 选 得 到 表 达 人 C?D?5?9? 蛋 白 最 强 细 胞 株 。 与 含 有 异 种 活 性 抗 体 和 补 体 的 人 血 清 和 猴 血 清 共 孵 育 , 分 析 乳 酸 脱 氢 酶 ( I?a?c?t?i?c? d?e?-? h?y?d?r?O?g?e?n?a?S?e?, L?D?H?) 释 放 率 测 定 人 C?D?5?9? 蛋 白 功 能 活 性 。 结 果 : 与 未 转 基 因 的 对 照 组 细 胞 比 较 , 表 达 人 C?D?5?9? 蛋 白 组 细 胞 与 不 同 浓 度 人 血 清 和 猴 血 清 共 孵 育 时 , 人 血 清 和 猴 血 清 中 补 体 及 抗 体 对 这 些 细 胞 的 杀 伤 作 用 被 显 著 抑 制 , 统 计 学 检 验 差 异 有 显 著 性 。 结 论 : 通 过 转 基 因 方 法 在 鼠 血 管 平 滑 肌 细 胞 膜 上 表 达 人 补 体 调 节 蛋 白 , 能 使 异 种 移 植 超 急 性 排 斥 反 应 得 到 抑 制 。 [ 中 图 分 类 号 ] O?3?4?3?.?l?2?-?3?3?2?[ 文 献 标 识 码 ] A?[ 文 章 编 号 ] l?0?0?0?-?l?5?3?0? ( 2?0?0?0?) 0?5?-?0?4?l?9?-?0?4? T?h?e? e?x?p?e?r?i?m?e?n?t?a?l? S?t?u?d?y? O?f? t?r?a?n?S?f?e?c?t?i?n?g? t?h?e? h?u?m?a?n? C?D?5?9? g?e?n?e? i?n?t?O? t?h?e? r?a?t? a?O?r?t?i?c? S?m?O?O?t?h? m?u?S?c?l?e? c?e?l?l?S? M?A?N? G?u?O?-?T?O?n?g?, Z?H?A?N?G? T?O?n?g?-?L?i?n?, Z?H?O?U? X?i?a?O?-?S?i? ( D?e?p?a?r?t?m?e?n?t? O?f? S?u?r?g?e?r?y?, P?e?k?i?n?g? U?n?i?V?e?r?S?i?t?y? T?h?i?r?d? H?O?S?p?i?t?a?I?, B?e?i?j?i?n?g?l?0?0?0?8?3?, C?h?i?n?a?) K?E?Y? W?0?R?D?S?M?u?S?c?I?e?, S?m?O?O?t?h?, V?a?S?c?u?I?a?r?; G?r?a?f?t? r?e?j?e?c?t?i?O?n?; C?D?5?9? p?r?O?t?e?i?n?; T?r?a?n?S?p?I?a?n?t?a?t?i?O?n?, h?e?t?e?r?O?I?O?-? g?O?u?S? A?B?S?T?R?A?C?T?0?b?j?e?c?t?i?V?e?: T?O? i?n?V?e?S?t?i?g?a?t?e? t?h?e? i?n?h?i?b?i?t?i?O?n? e?f?f?e?c?t?S? O?f? e?X?p?r?e?S?S?i?n?g? O?n?e? O?f? t?h?e? h?u?m?a?n? c?O?m?p?I?e?-? m?e?n?t? r?e?g?u?I?a?t?O?r?y? p?r?O?t?e?i?n?S?, C?D?5?9?, O?n? t?h?e? m?e?m?b?r?a?n?e? O?f? c?u?I?t?u?r?e?d? r?a?t? a?O?r?t?i?c? S?m?O?O?t?h? m?u?S?c?I?e? c?e?I?I?S? ( R?A?S?M?-? C?S?) O?n? t?h?e? h?y?p?e?r?a?c?u?t?e? r?e?j?e?c?t?i?O?n? O?f? X?e?n?O?t?r?a?n?S?p?I?a?n?t?a?t?i?O?n?.? M?e?t?h?O?d?S?: R?A?S?M?C?S?, H?U?V?E?C?S? ( h?u?m?a?n? u?m?b?i?I?-? i?c?a?I? V?e?i?n? e?n?d?O?t?h?e?I?i?a?I? c?e?I?I?S?) , w?e?r?e? S?e?p?a?r?a?t?e?I?y? i?S?O?I?a?t?e?d? f?r?O?m? f?r?e?S?h?I?y? O?b?t?a?i?n?e?d? r?a?t? a?O?r?t?a?, h?u?m?a?n? u?m?b?i?I?i?c?a?I? c?O?r?d?S?.? T?h?e?S?e? c?e?I?I?S?’ i?d?e?n?t?i?t?i?e?S? w?e?r?e? c?O?n?f?i?r?m?e?d? b?y? f?I?u?O?r?e?S?c?e?n?t? a?n?d? i?m?m?u?n?O?h?i?S?t?O?c?h?e?m?i?S?t?r?y? m?e?t?h?O?d?S?.? T?h?e? e?u?k?a?r?y?O?t?i?c? e?X?p?r?e?S?S?i?O?n? V?e?c?t?O?r? c?O?n?t?a?i?n?i?n?g? t?h?e? h?u?m?a?n? C?D?5?9? c?D?N?A?, L?X?S?N?-?C?D?5?9? w?a?S? c?O?n?S?t?r?u?c?t?e?d?.? T?h?e? e?X?p?r?e?S?S?i?O?n? V?e?c?t?O?r?S?, L?X?S?N? a?n?d? L?X?S?N?-?C?D?5?9?, w?e?r?e? t?r?a?n?S?f?e?c?t?e?d? i?n?t?O? t?h?e? R?A?S?M?C?S? w?i?t?h? L?i?p?O?f?e?c?t?i?n?m?i?n?e? m?e?d?i?a?t?e?d? m?e?t?h?O?d?.? S?t?a?b?I?e? t?r?a?n?S?f?e?c?t?a?n?t?S? w?e?r?e? S?e?I?e?c?t?e?d? u?S?i?n?g? 4?0?0?-?8?0?0? m?g?· L? -? l? G?4?l?8?.? C?e?I?I?S? e?X?p?r?e?S?S?i?n?g? t?h?e? h?i?g?h?e?S?t? I?e?V?e?I? O?f? h?u?m?a?n? C?D?5?9? p?r?O?t?e?i?n? w?e?r?e? S?e?I?e?c?t?e?d? b?y? F?A?C?S?.? T?h?e? f?u?n?c?t?i?O?n? O?f? t?h?e? h?C?D?5?9? p?r?O?t?e?i?n? e?X?p?r?e?S?S?e?d? O?n? t?h?e? m?e?m?b?r?a?n?e? O?f? t?h?e? R?A?S?M?C?S? w?a?S? d?e?t?e?r?m?i?n?e?d? b?y? i?n?c?u?b?a?t?i?O?n? w?i?t?h? h?u?m?a?n? S?e?r?u?m? a?n?d? m?O?n?k?e?y? S?e?r?u?m? t?h?a?t? c?O?n?t?a?i?n?e?d? t?h?e? X?e?n?O?r?e?a?c?t?i?V?e? a?n?t?i?b?O?d?y? a?n?d? c?O?m?p?I?e?m?e?n?t?.? T?h?e? f?u?n?c?t?i?O?n?t?a?I? a?c?t?i?V?i?t?y? O?f? t?h?e? p?r?O?t?e?i?n? w?a?S? m?e?a?S?u?r?e?d? u?S?i?n?g? a?n? L?D?H? r?e?I?e?a?S?e? a?S?S?a?y?.? R?e?S?u?l?t?S?: C?O?m?p?a?r?e?d? w?i?t?h? t?h?e? c?O?n?t?r?O?I? c?e?I?I?S?, w?h?e?n? t?h?e? c?e?I?I?S? e?X?p?r?e?S?S?i?n?g? t?h?e? h?C?D?5?9? p?r?O?t?e?i?n? w?e?r?e? i?n?c?u?b?a?t?e?d? w?i?t?h? h?u?m?a?n? S?e?r?u?m? O?r? m?O?n?k?e?y? S?e?r?u?m?, t?h?e? c?y?t?O?-? t?O?X?i?t?y? c?a?u?S?e?d? b?y? X?e?n?O?a?n?t?i?b?O?d?y? a?n?d? c?O?m?p?I?e?m?e?n?t? w?a?S? S?i?g?n?i?f?i?c?a?I?I?y? d?e?c?r?e?a?S?e?d?.? C?O?n?c?l?u?S?i?O?n?: T?h?e? h?y?p?e?r?a?c?u?t?e? r?e?j?e?c?t?i?O?n? O?f? t?h?e? X?e?n?O?t?r?a?n?S?p?I?a?n?t?a?t?i?O?n? m?a?y? b?e? i?n?h?i?b?i?t?e?d? t?h?r?O?u?g?h? e?X?p?r?e?S?S?i?n?g? t?h?e? h?u?m?a?n? c?O?m?p?I?e?m?e?n?t? r?e?g?u?-? I?a?t?O?r?y? p?r?O?t?e?i?n?S? O?n? t?h?e? m?e?m?b?r?a?n?e? O?f? t?h?e? R?A?S?M?C?S? b?y? t?r?n?S?g?e?n?i?c? m?e?t?h?O?d?S?.? ( ? B?e?i?j?i?n?g? M?e?d? U?n?i?1?, 2?0?0?0?, 3?2?: 4?l?9?-?4?2?2?) 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 ( 3?9?6?7?0?7?l?0?, 3?9?7?7?0?7?6?4?) 资 助 项 目 。 · 9?l?4?· 北 京 医 科 大 学 学 报 J?O?U?R?N?A?L? O?F? B?E?I?J?I?N?G? M?E?D?I?C?A?L? U?N?I?V?E?R?S?I?T?Y?V?O?I?.?3?2?N?O?.?5?O?c?t?.?2?0?0?0? 在 异 种 移 植 超 急 性 排 斥 反 应 中 , 受 者 补 体 系 统 激 活 使 供 者 器 官 血 管 内 皮 细 胞 受 到 损 伤 起 着 关 键 作 用 。 有 人 提 出 通 过 转 基 因 方 法 在 异 种 动 物 的 血 管 内 皮 细 胞 膜 上 表 达 人 的 补 体 调 节 蛋 白 , 从 而 抑 制 超 急 性 排 斥 反 应 [ l?, 2?] 。 但 是 , 超 急 性 排 斥 反 应 发 生 时 , 当 血 管 内 皮 细 胞 受 到 损 害 后 , 血 管 通 透 性 增 加 , 血 液 内 补 体 , 抗 体 等 可 渗 透 到 内 膜 下 , 与 血 管 平 滑 肌 细 胞 接 触 , 对 血 管 平 滑 肌 亦 造 成 损 害 [ 3?, 4?] 。 因 此 , 除 在 异 种 器 官 血 管 内 皮 细 胞 膜 上 表 达 人 补 体 调 节 蛋 白 , 亦 有 必 要 在 血 管 平 滑 肌 细 胞 膜 上 表 达 人 补 体 调 节 蛋 白 , 即 使 在 血 管 内 皮 细 胞 受 到 损 害 的 情 况 下 , 血 管 平 滑 肌 细 胞 上 的 补 体 调 节 蛋 白 仍 能 对 补 体 反 应 进 行 调 节 。 在 本 研 究 中 , 我 们 构 建 了 人 补 体 调 节 蛋 白 C?D?5?9? c?D?N?A?的 真 核 细 胞 表 达 载 体 L?X?S?N?-?C?D?5?9?, 将 L?X?S?N?-?C?D?5?9? 转 化 进 鼠 血 管 平 滑 肌 细 胞 , 得 到 表 达 人 C?D?5?9? 蛋 白 的 细 胞 克 隆 。 将 这 些 细 胞 克 隆 与 不 同 浓 度 梯 度 的 人 和 猴 血 清 共 孵 育 。 观 察 人 C?D?5?9? 蛋 白 是 否 对 这 些 细 胞 克 隆 有 保 护 作 用 。 1?材 料 与 方 法 1?.?1?材 料 含 人 C?D?5?9?c?D?N?A? 的 质 粒 p?F?R?S?V?!?-?C?D?5?9? 由 美 国 耶 鲁 大 学 B?O?t?1?w?e?1?1? 教 授 馈 赠 [ 5?] 。 大 肠 杆 菌 菌 株 J?m?l?0?9?、 D?H?5?!?及 逆 转 录 病 毒 表 达 载 体 p?L?X?S?N? 来 自 北 京 大 学 第 三 医 院 儿 科 病 毒 实 验 室 。 E?c?o?R?“?、 B?a?m?H?“?限 制 性 内 切 酶 、 T?4? D?N?A? 连 接 酶 、 牛 小 肠 碱 性 磷 酸 酶 、 蛋 白 酶 K?、 不 含 D?N?A? 酶 的 R?N?A? 酶 等 分 别 购 自 P?I?O?m?e?g?a?、 东 方 科 技 、 华 美 生 物 工 程 等 公 司 。 W?i? ?t?a?I? 大 鼠 购 自 北 京 大 学 医 学 部 实 验 动 物 科 学 部 。 人 脐 带 由 北 京 大 学 第 三 医 院 妇 产 科 提 供 。 胰 酶 、 肝 素 钠 购 自 S?i?g?m?a? 公 司 。 胶 原 酶 “?型 、 D?M?E?M? 培 养 基 、 M?l?9?9? 培 养 基 、 胎 牛 血 清 购 自 G?i?D?c?O? B?R?L? 公 司 。 小 牛 血 清 购 自 北 京 北 郊 农 场 。 内 皮 细 胞 生 长 因 子 购 自 B?O?e?1?I?i?D?g?e?I? M?a?D?1?e?i?m? 公 司 。 L?i?p?O?f?e?c?t?i?D?m?i?D?e?、 G?4?l?8? 购 自 G?i?D?c?O? B?R?L? 公 司 。 小 鼠 抗 人 C?D?5?9? 单 克 隆 抗 体 由 第 三 军 医 大 学 免 疫 学 教 研 室 白 云 教 授 馈 赠 。 羊 抗 小 鼠 I?g?G?( F?I?T?C? 标 记 ) 购 自 北 京 邦 定 生 物 工 程 公 司 。 1?.?2?实 验 方 法 1?.?2?.?1?L?X?S?N?-?C?D?5?9? 逆 转 录 病 毒 表 达 载 体 的 构 建 、 扩 增 、 纯 化 及 鉴 定 [ 3?] E?c?o?R?“?酶 切 质 粒 p?F?R?S?V?!?-? C?D?5?9?, 得 到 4?7?6? D?p?的 人 C?D?5?9?c?D?N?A?, 低 溶 点 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 回 收 C?D?5?9?c?D?N?A?; E?c?o?R?“?酶 切 p?L?X?S?N? 逆 转 录 病 毒 表 达 载 体 , 去 磷 酸 化 处 理 。 将 人 C?D?5?9?c?D?N?A? 插 入 到 载 体 p?L?X?S?N? 中 。 用 C?a?C?1?2?法 转 染 大 肠 杆 菌 D?H?5?!?, A?m?p?抗 性 筛 选 阳 性 菌 落 , 小 量 扩 增 阳 性 菌 落 , 碱 裂 解 法 抽 提 质 粒 , 分 别 用 E?c?o?R?“?, B?a?m?H?“?酶 切 , l?0? g?· L? -? l?琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 , 紫 外 灯 下 观 察 结 果 , 选 取 插 有 人 C?D?5?9?c?D?N?A? 且 方 向 正 确 的 克 隆 进 行 大 量 抽 提 。 聚 乙 二 醇 8?0?0?0?( P?E?G?8?0?0?0?) 沉 淀 法 纯 化 质 粒 , 紫 外 分 光 光 度 法 测 定 质 粒 D?N?A? 含 量 , 以 2?6?0? D?m? 与 2?8?0? D?m? 光 密 度 的 比 值 估 计 D?N?A? 纯 度 。 1?.?2?.?2?细 胞 培 养 大 鼠 主 动 脉 平 滑 肌 细 胞 : W?i? ?t?a?I? 大 鼠 处 死 , 无 菌 条 件 下 取 主 动 脉 , 取 血 管 中 膜 的 内 、 中 层 , 组 织 块 贴 壁 法 在 盛 有 D?M?E?M? 培 养 液 [ 含 l?0?%? ( 体 积 分 数 ) 小 牛 血 清 , 青 霉 素 l?0?0? u? · m?1?-? l?, 链 霉 素 l?0?0? m?g?· L?-? l?] 的 培 养 瓶 内 静 置 培 养 获 得 纯 平 滑 肌 细 胞 。 相 差 显 微 镜 观 察 及 !?-?平 滑 肌 肌 动 蛋 白 免 疫 组 化 染 色 鉴 定 大 鼠 主 动 脉 平 滑 肌 细 胞 。 人 脐 静 脉 内 皮 细 胞 培 养 : 取 健 康 产 妇 分 娩 后 新 鲜 脐 带 , 2?.?5? g?· L?-? l?胰 酶 消 化 得 到 人 脐 静 脉 内 皮 细 胞 , 用 M?l?9?9? 培 养 液 [ 含 2?0?%? ( 体 积 分 数 ) 胎 牛 血 清 , 青 霉 素 l?0?0? u? · m?1?-? l?, 链 霉 素 l?0?0? m?g?· L?-? l?, 内 皮 细 胞 生 长 因 子 2?0? m?g?· L?-? l?, 肝 素 钠 l?0?0? u? · m?1?-? l?] 混 悬 细 胞 接 种 培 养 。 相 差 显 微 镜 观 察 及 人 第 8? 因 子 相 关 抗 原 抗 血 清 免 疫 组 化 检 测 鉴 定 人 脐 静 脉 内 皮 细 胞 。 1?.?2?.?3?基 因 转 染 及 转 染 细 胞 筛 选 脂 质 体 转 染 法 ( L?i?p?O?f?e?c?t?i?D?m?i?D?e?) 将 L?X?S?N?-?C?D?5?9?、 L?X?S?N? 转 化 进 鼠 血 管 平 滑 肌 细 胞 , G?4?l?8? 筛 选 ( G?4?l?8? 剂 量 从 2?0?0? m?g? · L?-? l?开 始 , 在 两 周 内 升 至 8?0?0? m?g?· L?-? l?) 得 到 阳 性 细 胞 克 隆 , 将 阳 性 克 隆 转 移 至 2?4? 孔 板 , 4?0?0? m?g?· L?-? l? G?4?l?8? 维 持 , 继 续 培 养 至 8?0?%?融 合 , 传 代 , 保 种 。 1?.?2?.?4?流 式 细 胞 仪 测 定 细 胞 表 面 C?D?5?9? 蛋 白 表 达 人 脐 静 脉 内 皮 细 胞 、 转 染 及 未 转 染 L?X?S?N?-?C?D?5?9?、 L?X?S?N? 的 鼠 血 管 平 滑 肌 细 胞 与 鼠 抗 人 C?D?5?9? 单 克 隆 抗 体 、 F?I?T?C? 标 记 的 羊 抗 鼠 I?g?G? 共 孵 育 , 在 流 式 细 胞 仪 上 测 定 上 述 细 胞 膜 表 面 人 C?D?5?9? 蛋 白 表 达 情 况 , 得 到 表 达 人 C?D?5?9? 蛋 白 的 细 胞 克 隆 , 传 代 , 保 种 。 1?.?2?.?5?人 C?D?5?9? 蛋 白 在 鼠 血 管 平 滑 肌 细 胞 表 达 后 功 能 测 定 已 转 基 因 且 表 达 人 C?D?5?9? 蛋 白 和 未 转 基 因 之 鼠 血 管 平 滑 肌 细 胞 , 接 种 于 2?4? 孔 板 , 待 l?0?0?%? 融 合 时 , P?B?S? 洗 2? 遍 , D?M?E?M? 培 养 基 中 以 下 述 终 浓 度 ( 体 积 分 数 ) 梯 度 加 入 人 血 清 和 猴 血 清 : 5?%?、 l?0?%?、 l?5?%?、 2?0?%?、 2?5?%?, 于 5?%? ( 体 积 分 数 ) C?0?2?, 9?5?%? ( 体 积 分 数 ) 空 气 , 3?7?C?孵 育 0?.?5? 1?, 吸 取 培 养 液 测 定 L?D?H? 漏 出 率 , 测 量 值 记 为 E?; 测 定 与 E? 相 应 的 含 上 述 不 同 浓 度 人 和 猴 血 清 未 与 细 胞 共 孵 育 的 培 养 基 中 乳 酸 · 0?2?4?· 北 京 医 科 大 学 学 报 J?0?U?R?N?A?L? 0?F? B?E?I?J?I?N?G? M?E?D?I?C?A?L? U?N?I?V?E?R?S?I?T?Y?V?O?1?.?3?2?N?O?.?5?0?c?t?.?2?0?0?0? 脱 氢 酶 ( 1?a?c?t?i?c? c?e?1?y?c?r?O?g?e?D?a?S?e?, L?D?H?) 漏 出 率 , 记 为 S?; 无 血 清 培 养 基 与 不 同 细 胞 共 孵 育 , 测 定 其 中 L?D?H? 漏 出 率 , 记 为 N?; 在 无 血 清 培 养 基 中 孵 育 后 完 全 裂 解 细 胞 时 的 L?D?H?, 记 为 M?, 按 下 式 计 算 L?D?H? 漏 出 率 : C?y?t?O?t?O?X?i?t?y?( ?) ? E? ? N? ? S? M? ? N? X? l?0?0? 在 本 实 验 中 , L?D?H? 漏 出 率 大 小 反 应 人 血 清 或 猴 血 清 中 补 体 介 导 的 鼠 血 管 平 滑 肌 细 胞 毒 性 反 应 大 小 , 即 C?D?5?9? 蛋 白 对 鼠 血 管 平 滑 肌 细 胞 保 护 作 用 的 弱 或 强 。 1?.?2?.?6?统 计 学 处 理 所 有 计 量 资 料 用 !? x? 1? s? 表 示 , 统 计 方 法 用 双 侧 t?-?检 验 , P? ? 0?.?0?5? 被 认 为 差 异 具 有 显 著 性 。 2?结 果 2?.?1?人 C?D?5?9?c?D?N?A? 逆 转 录 病 毒 表 达 载 体 L?X?S?N?-? C?D?5?9? 的 构 建 及 鉴 定 从 连 接 反 应 后 转 化 细 菌 铺 板 所 得 的 菌 落 中 , 挑 选 多 个 克 隆 , 小 提 后 进 行 E?c?O?R?!?及 B?a?m?H?!?酶 切 鉴 定 。 E?c?O?R?!?酶 切 证 实 有 C?D?5?9?c?D?N?A? 片 段 克 隆 入 L?X?S?N? 载 体 中 , 而 B?a?m?H?!?酶 切 证 实 C?D?5?9?c?D?N?A? 插 入 方 向 正 确 。 P?C?R? 方 法 测 定 进 一 步 得 到 证 实 。 2?.?2?L?X?S?N?-?C?D?5?9? 脂 质 体 介 导 转 染 鼠 血 管 平 滑 肌 细 胞 利 用 G?4?l?8? 进 行 阳 性 克 隆 细 胞 筛 选 。 两 周 内 开 始 出 现 阳 性 克 隆 。 2?.?3?流 式 细 胞 仪 测 定 人 C?D?5?9? 蛋 白 在 鼠 血 管 平 滑 肌 细 胞 膜 上 的 表 达 经 G?4?l?8? 筛 选 出 的 克 隆 , 并 非 在 膜 上 都 表 达 人 C?D?5?9? 蛋 白 , 且 表 达 的 量 也 不 一 致 。 本 实 验 以 人 脐 静 脉 内 皮 细 胞 为 阳 性 对 照 , 经 流 式 细 胞 仪 筛 选 , 得 到 表 达 最 强 者 , 扩 展 培 养 并 冻 存 保 种 。 正 常 鼠 血 管 平 滑 肌 细 胞 、 转 染 对 照 质 粒 L?X?S?N? 的 鼠 血 管 平 滑 肌 细 胞 均 不 表 达 人 C?D?5?9? 蛋 白 。 测 定 结 果 见 图 l?。 2?.?4?补 体 介 导 的 细 胞 溶 解 率 测 定 以 未 转 基 因 的 鼠 血 平 滑 肌 细 胞 作 为 阴 性 对 照 , 测 定 结 果 见 表 l?。 实 验 结 果 表 明 , 与 对 照 组 细 胞 比 较 , 表 达 人 C?D?5?9? 蛋 白 的 细 胞 与 不 同 浓 度 人 血 清 和 猴 血 清 共 孵 育 时 , 人 血 清 和 猴 血 清 中 补 体 及 抗 体 对 这 些 细 胞 的 杀 伤 作 用 被 显 著 抑 制 , 统 计 学 检 验 差 异 有 显 著 性 ( P? ? 0?.?0?l?) 。 3?讨 论 异 种 移 植 超 急 性 排 斥 反 应 由 受 者 的 天 然 抗 体 与 供 者 器 官 的 血 管 内 皮 细 胞 结 合 , 进 而 激 活 受 者 补 体 系 统 而 引 发 。 移 植 器 官 在 数 分 钟 至 数 小 时 内 发 生 广 泛 性 血 管 内 凝 血 及 实 质 内 出 血 而 丧 失 功 能 甚 或 坏 死 [ 6?] 。 P?1?a?t?t? [ 5?] 和 D?a?1?1?m?a?1?S?S?O? [ l?] 等 最 先 提 出 将 人 的 补 体 调 节 蛋 白 在 异 种 动 物 的 血 管 内 皮 细 胞 上 表 达 , 以 达 到 抑 制 异 种 移 植 时 人 血 清 中 补 体 激 活 所 导 致 的 超 急 性 排 斥 反 应 的 目 的 [ 2?, 7?] 。 C?D?5?9? 是 存 在 于 人 和 动 物 的 血 细 胞 、 内 皮 细 胞 膜 上 的 一 种 补 体 调 节 蛋 白 , 作 用 于 补 体 级 联 反 应 的 终 末 阶 段 , 即 M?A?C? ( m?e?m?D?r?a?D?e? a?t?t?a?c?k? c?O?m?p?1?e?X?) 形 成 阶 段 。 无 论 经 典 途 径 抑 或 替 代 途 径 , 补 体 激 活 的 最 终 阶 段 均 为 形 成 M?A?C?。 M?A?C? 一 经 形 成 , 就 插 入 到 靶 细 胞 膜 上 , 形 成 一 个 跨 膜 的 穿 越 脂 质 双 层 的 亲 水 性 通 道 , 引 起 细 胞 裂 解 [ 8? ~? l?0?] 。 A?, t?1?e? 1?u?m?a?D? u?m?D?i?1?i?c?a?1? V?e?i?D? e?D?c?O?t?1?e?1?i?a?1? c?e?1?1?S? a?S? t?1?e? p?O?S?i?t?i?V?e? c?O?D?t?r?O?1?S?; B?, t?1?e? r?a?t? S?M?C?S? D?O?D?-?t?r?a?D?S?f?e?c?t?e?c? g?e?D?e?S? a?S? t?1?e? D?e?g?a?t?i?V?e? c?O?D?t?r?O?1?S?; C?, t?1?e? r?a?t? S?M?C?S? t?r?a?D?S?f?e?c?t?e?c? w?i?t?1? L?X?S?N? a?S? t?1?e? c?O?D?t?r?O?1?S? e?X?c?1?u?c?i?D?g? t?1?e? i?D?f?1?u?e?D?c?e? O?f? t?1?e? e?X?p?r?e?S?S?i?O?D? V?e?c?t?O?r?; D?, t?1?e? r?a?t? S?M?C?S? t?r?a?D?S?f?e?c?t?e?c? w?i?t?1? L?X?S?N?-?C?D?5?9?( T?1?e? a?D?S?c?i?S?S?a? S?1?O?w? t?1?e? f?1?u?O?r?e?S?c?e?D?c?e? i?D?t?e?D?S?i?t?y?.? T?1?e? O?r?c?i?D?a?t?e? S?1?O?w? t?1?e? D?u?m?D?e?r? O?f? c?e?1?1?S?.?) .? 图 1? 流 式 细 胞 仪 测 定 人 C?D?5?9? 蛋 白 在 鼠 血 管 平 滑 肌 细 胞 的 表 达 F?i?g?u?r?e? 1?F?1?O?w? c?y?t?O?m?e?t?r?y? a?D?a?1?y?S?i?S? O?f? 1?u?m?a?D? C?D?5?9? e?X?p?r?e?S?S?i?O?D? O?D? t?1?e? m?e?m?D?r?a?D?e? O?f? t?1?e? S?m?O?O?t?1? m?u?S?c?1?e? c?e?1?1?S? c?e?S?c?r?i?D?e?c? a?S? f?O?1?1?O?w?S? 在 排 斥 反 应 引 起 的 炎 症 反 应 中 , 内 皮 细 胞 发 生 如 下 的 变 化 : ( l?) 内 皮 细 胞 收 缩 ; ( 2?) 内 皮 细 胞 骨 架 和 结 合 的 重 构 ; ( 3?) 伴 有 收 缩 、 溶 解 、 和 剥 脱 的 内 皮 细 胞 损 伤 ; ( 4?) 不 伴 有 溶 解 的 内 皮 细 胞 剥 脱 [ 9?] 。 内 皮 细 胞 发 生 上 述 变 化 之 后 , 血 液 内 成 分 , 如 补 体 、 抗 体 、 各 种 细 胞 因 子 等 , 渗 出 到 血 管 内 皮 下 或 血 管 外 , 对 平 滑 肌 细 胞 等 造 成 损 害 [ 2?, 3?, 7?] 。 因 此 , 除 在 异 种 器 官 血 管 内 皮 细 胞 膜 上 表 达 人 补 体 调 节 蛋 白 , 亦 有 必 要 在 血 管 平 滑 肌 细 胞 膜 上 表 达 人 补 体 调 节 蛋 白 , 即 使 在 血 管 内 皮 细 胞 受 到 损 害 的 情 况 下 , 血 管 平 滑 肌 细 胞 上 的 补 体 调 节 蛋 白 仍 能 对 补 体 反 应 进 行 调 节 。 补 体 调 节 蛋 白 的 作 用 有 种 属 特 异 性 。 但 有 研 究 · l?2?4?· 满 国 彤 , 等 鼠 血 管 平 滑 肌 细 胞 转 人 C?D?5?9? 基 因 的 实 验 研 究 者 指 出 , 在 种 系 发 生 上 相 近 的 动 物 , 进 化 上 较 高 级 动 物 的 补 体 调 节 蛋 白 对 较 低 级 动 物 的 补 体 有 调 节 作 用 。 如 人 的 补 体 调 节 蛋 白 对 猴 的 补 体 有 调 节 作 用 , 反 之 则 不 能 [ 8?] 。 在 本 实 验 中 , 我 们 将 人 C?D?5?9?c?D?N?A? 的 表 达 载 体 L?X?S?N?-?C?D?5?9? 转 化 进 鼠 血 管 平 滑 肌 细 胞 , 通 过 流 式 细 胞 仪 测 定 得 到 表 达 人 C?D?5?9? 蛋 白 的 细 胞 克 隆 , 观 察 到 表 达 在 鼠 血 管 平 滑 肌 细 胞 膜 上 的 人 补 体 调 节 蛋 白 , 可 抑 制 人 血 清 和 猴 血 清 中 补 体 对 鼠 血 管 平 滑 肌 细 胞 的 损 害 作 用 。 这 说 明 用 转 基 因 方 法 抑 制 超 急 性 排 斥 反 应 , 除 了 在 血 管 内 皮 细 胞 膜 上 表 达 人 补 体 调 节 蛋 白 外 , 在 血 管 平 滑 肌 细 胞 膜 上 表 达 也 可 能 起 一 定 作 用 。 我 们 将 进 行 进 一 步 的 研 究 , 如 通 过 显 微 注 射 方 法 生 产 转 基 因 动 物 , 使 其 血 管 内 皮 及 平 滑 肌 细 胞 均 表 达 人 补 体 调 节 蛋 白 C?D?5?9?, 以 克 服 异 种 移 植 超 急 性 排 斥 反 应 。 表 1? 人 、 猴 血 清 介 导 的 鼠 血 管 平 滑 肌 细 胞 L?D?H? 漏 出 率 ( !?x? 1? s? , n? =? 6?, ?) T?a?b?l?e? 1?T?1?e? L?D?H? 1?e?a?k?a?g?e? r?a?t?e? m?e?c?i?a?t?e?c? D?y? t?1?e? 1?u?m?a?D? O?r? m?O?D?k?e?y? S?e?r?u?m? ( !?x? 1? s? , n? =? 6?, ?) G?r?O?u?p?S? T?1?e? p?e?r?c?e?D?t? O?f? t?1?e? 1?u?m?a?D? S?e?r?u?m? i?D? t?1?e? c?u?1?t?u?r?e? m?e?c?i?u?m? ( ?) 5?l?0?l?5?2?0?2?5? L?X?S?N?-?C?D?5?9?3?.?3? 1? l?.?2?“?“?7?.?9? 1? 2?.?8?“?“?l?0?.?2? 1? 3?.?4?“?“?l?l?.?9? 1? 4?.?8?“?“?l?9?.?3? 1? 8?.?2?“?“? C?O?D?t?r?O?1?l?0?.?5? 1? 3?.?2?2?0?.?l? 1? 6?.?8?3?0?.?0? 1? l?5?.?4?4?6?.?4? 1? 9?.? #?#? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? #? 2?5?9?.?0? 1? l?2?.?0? G?r?O?u?p?S? T?1?e? p?e?r?c?e?D?t? O?f? t?1?e? m?O?D?k?e?y? S?e?r?u?m? i?D? t?1?e? c?u?1?t?u?r?e? m?e?c?i?u?m? ( ?) 5?l?0?l?5?2?0?2?5? L?X?S?N?-?C?D?5?9?6?.?3? 1? 2?.?0?“?“?8?.?7? 1? 3?.?4?“?“?l?l?.?2? 1? 3?.?3?“?“?l?7?.?8? 1? 5?.?3?“?“?2?0?.?0? 1? 4?.?3?“?“? C?O?D?t?r?O?1?l?6?.?2? 1? 7?.?3?l?8?.?8? 1? 6?.?8?2?7?.?4? 1? 9?.?0?5?4?.?2? 1? l?5?.?0?6?3?.?8? 1? l?2?.?3? “?“?P? ? 0?.?0?l?, c?O?m?p?a?r?e?c? w?i?t?1? c?O?D?t?r?O?1?.? 参 考 文 献 l?D?a?1?m?a?S?S?O? A?P?, V?e?r?c?e?1?O?t?t?i? G?M?, P?1?a?t?t? J?L?, e?t? a?l?.? I?D?1?i?D?i?t?i?O?D? O?f? c?O?m?-? p?1?e?m?e?D?t
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