尿ⅳ型胶原 一种早期糖尿病肾病的预测指标.pdf

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编号:20181206085305784179    类型:共享资源    大小:175.08KB    格式:PDF    上传时间:2019-02-16
  
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尿ⅳ型胶原一种早期糖尿病肾病的预测指标
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·论著· 基金项目: 国家 !“# 高技术研究发展计划资助项目 ($% 98?@A;8) 中得到高水 平分泌表达, 产生全长重组蛋白。识别构象表位的特异性单克隆抗体能与该重组蛋白反应。结论 重新设计的基因能在毕赤酵母中高水平分泌表达, 并产生构象正确的重组蛋白, 从而解决了该天然基 因在毕赤酵母中不表达的问题。 【关键词】 毕赤酵母; 疟原虫, 恶性; 基因, 合成; 裂殖子表面蛋白 $ !“#$%-/)?501)./ @/)7,’,’9+=C(’ 【CD’$-)B? 9A@?F;B G;?= ?;@B ;B 6; 98?@A;8 E@A H88IJ =8FC 7F?=@C G8 D?;L;MFC ?@ 8IB?=F8;MF ?=F $ BN 9L87;C ;B;BN ?=F 8IB?=F?;8 ;B?A@CD 98?@A;8 :I FLF?;@BJ /=F 8F8 CF?F8 NFBFA?FC G;?= FAA@A’EAFF, BC FO9AF88FC ?@ 9A@CDB? 9A@?F;B ;B 8F?;@BL 7@B@L B?;:@CI 89FL B? 9A@?F;BJ 4.#8 FO9AF88FC ;B 6J98?@A;8 G;?= EDLL LFBN?= @E AFB? 9A@?F;B G=;?;HF 9A@?F;BJ 【H; 6L87@C;D7 ELAD7; RFBF8,8IB?=F?;?L 4FC X 3=;B,YF:ADAI $%, C+D 的氨基酸序列, 选用毕赤酵 母密码子使用频率, 对该基因的 ,-. 序列重新设 计。为使新设计的 :6EC+D 基因能在异源系统中表 达, 我们采用计算机软件 “,-. B%2RJ) 拼接合成基因: 基因合成的总体策略如图 所示 [+] 。基因拼接主 要步骤为: . S T N 个反应平行进行, ;RJ 反应条件 均为 P+UO 6!FFU@O 6!ADU :$“。为保证不对 称 ;RJ 扩增效率, 每个反应中两条寡核苷酸链的浓 度比例为 F V , FO“1 反应体系中含 *28 酶 (德国 4’)9RJ 循环之后 将 N 个反应的产物, 从前至后两两混合, 再进行 F 个 ;RJ 循环, 反应条件同前, 产生#、 $、%@ 个反应产 物; 之后在#、 $、%反应中分别加入 DO E:’1 寡核苷 酸 +DC、 +DCX 和 +DCD, 再进行 X 个 ;RJ 循环, 产生 RJ 反应, 产生反应产物), 在)中 加入 +DC, 再进行 X 个循环, 产生产物*。将*与( 混合, 经 X 个 ;RJ 循环即产生全长基因。经琼脂糖 凝胶电泳分离回收目的条带。 @?分子克隆、 质粒抽提、 酶切、 片段回收、 连接、 转化、 琼脂糖电泳、 核酸序列分析等均参照 《分子克 隆实验指南》 手册和相应试剂盒说明书进行。 +? 重组质粒转化入酵母细胞及鉴定: 毕赤酵母 菌株 B7, NX 单克隆菌入 Y;, 培养基 (Z酵母浸 出粉、 DZ多聚蛋白胨、 O? :’1[K 葡萄糖) 中培养至 !NOO值达 ?F 后离心收集菌体, 用电穿孔法进行转 化, 转化菌液涂布于组氨酸缺陷培养基 J,4 平板 ( :’1[K山梨醇, O? :’1[K 葡萄糖、 ? @+Z Y-4, \N+] O^ D::’1[K 生物素, O?OOFZ多种氨基酸混 合液) @OU培养直至转化子出现。制备酵母基因组 ,-., 用 ;RJ 方法鉴定目的基因整合入酵母细胞染 色体的阳性克隆。 F?重组质粒在毕赤酵母中的诱导表达: 将含有 重组表达质粒的 B7, NX 菌接种入 7=Y 培养基中 (? @+Z Y-4, Z 甘油, ? N+ ] O^ D::’1[K 生物 素) , 培养至 !NOO值 D S N 时, 更换为 477Y 培养基 (Z酵母浸出粉, DZ多聚蛋白胨, O? :’1[K 磷酸缓 冲液 E_ (N?O) , ?@+Z Y-4,?N+ ] O^ D::’1[K 生 物素, O\D+ :’1[K 甲醇) , 每天补加甲醇至终浓度为 O\D+ :’1[K, 不同时间点取样进行表达产物的检测。 ·PP·中华医学杂志 DOOD 年 D 月 O 日第 XD 卷第 @ 期-2%1 7)3 ‘ R9$“2,T)5、 合成基 因 *9:7%5-9及毕赤酵母密码子使用频率, 诸密码子 使用频率存在较大差别。 二、 不对称 - D#,E;C$ 万方数据 单抗 和 多 抗) 能 完 全 抑 制 恶 性 疟 原 虫 体 外 生 长 [ !“#$ ] 。用重组 %6 聚合酶的错误复制。这可能 是合成的寡核苷酸链中的少量不纯物质所致, 而这 些不纯物质的产生主要是由于在 06 自动合成过 程中长链寡核苷酸长时间接触合成过程中所使用的 试剂而产生的化学合成副反应。 参考文献 # %4QE3AQ 6QAG, D3,3@QN,#77#,)!: #$7(“##$/8 #. _4QE3AQ 6QAG, D3,3K8/ 万方数据
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