酶解-水扬酸盐光度法测定牛奶中的尿素.pdf

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水杨酸酶法 牛奶中尿素 牛奶中 酶解-水扬酸盐光度法测定牛奶中的尿素 尿素的酶法 法测定 尿素的
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文 章 编 号 : 1?0?0?1? -? 2?4?4?3? ( 2?0?0?0?) 0?2? -? 0?1?6?0? -? 0?2? 酶 解 -? 水 扬 酸 盐 光 度 法 测 定 牛 奶 中 的 尿 素 龚 仁 敏 1?, 汤 勇 铮 2?, 王 子 建 3? ( 1?.?安 徽 师 范 大 学 生 命 科 学 学 院 , 安 徽 芜 湖 2?4?1?0?0?0?; 2?.?皖 南 医 学 院 生 化 教 研 室 , 安 徽 芜 湖 2?4?1?0?0?1?; 3?.?阜 阳 城 郊 中 学 , 安 徽 阜 阳 2?3?6?0?2?5?) 摘 要 : 提 出 一 种 测 定 牛 奶 中 尿 素 的 新 方 法 , 以 刀 豆 粉 提 取 液 作 脲 酶 催 化 尿 素 水 解 产 生 氨 , 氨 由 水 扬 酸 盐 光 度 法 测 定 .? 本 法 中 有 色 化 合 物 的 最 大 吸 收 波 长 7?0?0?n?m?, 表 观 摩 尔 吸 光 系 数 E?7?0?0? =? 1?.? 3? ? 1?0?4?m?O?I?-? 1?.? L?.?c?m? -? 1?, 线 性 范 围 0? ~? 0?.?8?H?g?N? /? m?L?, , 检 出 限 1?.?1? ? 1?0? -? 6?g?N? /? L?.? 关 键 词 : 脲 酶 ; 尿 素 ; 氨 ; 水 扬 酸 盐 ; 光 度 法 中 图 分 类 号 : O?5? -? 3?3?文 献 标 识 码 : A? 尿 素 是 哺 乳 动 物 体 内 蛋 白 质 分 解 代 谢 的 终 产 物 , 所 以 也 少 量 存 在 于 牛 奶 中 , 牛 奶 中 尿 素 的 正 常 值 为 5?.?2? ~? 6?2?.?0?m?g?/?1?0?0?m?L? [ 1?] .?目 前 市 售 牛 奶 中 搀 假 现 象 时 有 发 生 , 其 中 向 搀 水 牛 奶 中 加 入 尿 素 等 含 氮 物 以 提 高 蛋 白 质 的 检 测 值 就 是 常 用 手 段 之 一 , 因 此 牛 奶 中 尿 素 的 检 测 就 成 为 牛 奶 质 量 监 测 的 一 项 重 要 内 容 .? 已 有 一 些 检 测 牛 奶 中 尿 素 的 方 法 [ 2?] , 文 献 [ 3?] 报 道 了 一 种 新 检 测 方 法 , 酶 解 -?纳 氏 光 度 法 .?经 过 实 验 , 我 们 以 刀 豆 粉 提 取 液 作 脲 酶 催 化 尿 素 水 解 产 生 氨 [ 4?] , 氨 在 碱 性 条 件 下 由 亚 硝 基 铁 氰 化 钠 催 化 , 与 次 氯 酸 盐 和 水 扬 酸 作 用 , 生 成 绿 色 化 合 物 , 可 比 色 测 定 [ 5?] : N?H?2?C?O?N?H?2?+? H?2?O? !? 脲 酶 2?N?H?3?+? C?O?2?, N?H?3?+? 3?N?a?C?I?O? +? 3?N?a?O?H? +? 2? C?O?2?H? O?H? 亚 硝 基 !? 铁 氰 化 钠 O? =? C?O?2?N?a? =?N? C?O?2?N?a? O?N?a?+? 3?N?a?C?I?+? 6?H?2?O?, 与 纳 氏 光 度 法 相 比 , 水 扬 酸 盐 光 度 法 有 灵 敏 度 高 , 比 色 液 是 真 溶 液 , 溶 液 颜 色 稳 定 , 再 现 性 好 等 优 点 , 此 外 还 消 除 了 纳 氏 试 剂 中 汞 对 环 境 的 污 染 .? !?实 验 部 分 !?.?!?仪 器 与 试 剂 7?2?1? 型 分 光 光 度 计 ( 上 海 第 三 分 析 仪 器 厂 ) ; 恒 温 水 浴 器 等 .? 脲 酶 溶 液 : 称 取 过 6?0? 目 的 刀 豆 粉 1?0?g? , 加 入 少 许 7?0?%?甘 油 研 磨 , 再 以 7?0?%?甘 油 稀 释 至 5?0?0?m?L?, 混 匀 , 沉 淀 后 取 上 层 液 使 用 ; 0?.?5?m?O?I?/? L? 硫 酸 : 量 取 2?8?.?0? m?L? 浓 硫 酸 溶 于 约 8?0?0?m?L? 无 氨 水 , 冷 后 补 水 至 1?0?0?0?m?L?; 1?0?%?钨 酸 钠 : 称 取 5?0?g? 钨 酸 钠 , 用 无 氨 水 溶 解 并 稀 释 至 5?0?0?m?L?; 氨 氮 标 准 液 : 准 确 称 取 0?.?4?7?1?7?g? 烘 干 的 硫 酸 铵 , 用 无 氨 水 溶 解 并 定 容 至 1?0?0?0?m?L?, 为 贮 备 液 , 吸 取 贮 备 液 5?.? 0?0?m?L?, 用 无 氨 水 稀 释 至 1?0?0?m?L? 为 氨 氮 浓 度 0?.? 0?0?5?m?g?/? m?L? 的 标 准 液 ; 显 色 液 : 液 I?: 称 取 1?0?.? 0?g?水 扬 酸 和 1?0?.? 0?g?柠 檬 酸 钠 ( 2?H?2?O?) 加 入 无 氨 水 5?0?m?L? 和 2?m?O?I?/? L? 氢 氧 化 钠 5?5?m?L?, 溶 解 后 补 水 至 2?0?0?m?L?; 液 H?: 称 取 亚 硝 基 铁 氰 化 钠 0?.?5?g? , 用 无 氨 水 溶 解 并 稀 释 至 5?0?0?m?L?; 液 U?: 浓 度 已 标 定 的 安 替 福 民 ( 次 氯 酸 钠 溶 液 ) 用 0?.?2?m?O?I?/? L? 氢 氧 化 钠 稀 释 成 0?.?0?0?5?m?O?I?/? L? 次 氯 酸 钠 溶 液 .? 安 替 福 民 的 标 定 : 称 取 2?.? 0?g? 碘 化 钾 于 2?5?0?m?L? 碘 量 瓶 中 , 加 5?0?m?L? 无 氨 水 溶 解 , 再 加 入 1?.?0?0?m?L? 安 替 福 民 和 0?.?5?m?L?1?I?1? 盐 酸 , 摇 匀 , 置 暗 处 3?m?i?n?, 用 0?.? 1?0?0?m?O?I?/?L? 硫 代 硫 酸 钠 滴 定 至 淡 黄 色 , 加 入 1?.? 0?m?L? 新 配 的 5?g?/? L? 淀 粉 液 , 呈 蓝 色 , 用 上 述 硫 代 硫 酸 钠 继 续 滴 定 至 蓝 色 褪 去 为 终 点 , 以 下 式 计 算 安 替 福 民 的 次 氯 酸 钠 浓 度 .? N?a?C?I?O? m?O?I?/? L? =? 2?C?V? /?1?.?0?0? 式 中 C? 为 硫 代 硫 酸 钠 溶 液 的 摩 尔 浓 度 , V? 为 滴 定 时 消 耗 的 硫 代 硫 酸 钠 的 m?L? 数 .? !?.?“?被 测 样 品 9?8?0?m?L?光 明 牌 纯 鲜 牛 奶 上 海 光 明 乳 业 有 限 公 司 乳 品 二 厂 2?5?0?m?L?古 城 牌 鲜 牛 奶 中 荷 合 资 山 西 古 城 依 美 口 乳 品 有 限 公 司 2?0?0?m?L?卫 岗 牌 A?D? 高 钙 鲜 牛 奶 南 京 奶 业 ( 集 团 ) 收 稿 日 期 : 1?9?9?9? -? 1?0? -? 2?9? 作 者 简 介 : 龚 仁 敏 ( 1?9?5?8? -? ) , 男 , 副 教 授 .? 第 2?3? 卷 2? 期 2?0?0?0?年 6?月 安 徽 师 范 大 学 学 报 ( 自 然 科 学 版 ) J?O?u?r?n?a?I? O?f? A?n?h?u?i? N?O?r?m?a?I? U?n?i?v?e?r?s?i?t?y?( N?a?t?u?r?a?I? S?c?i?e?n?c?e?) V?O?I?.?2?3? N?O?.?2? J?u?n? .? 2? 0? 0? 0? 公 司 乳 品 分 公 司 1?.?3?实 验 方 法 取 一 定 量 氨 氮 标 准 液 于 5?0?m?L? 比 色 管 中 , 依 次 加 入 显 色 液 I?2?.?5?0?m?L?, 显 色 液 H?5?.?0?0?m?L? 和 显 色 液 H?5?.?0?0?m?L?, 用 无 氨 水 定 容 至 刻 度 , 摇 匀 后 置 室 温 下 6?0?m?i?D?, 测 定 有 色 物 的 吸 收 光 谱 , 确 定 A?m?a?X?为 7?0?0?D?m?, 在 7?0?0?D?m? 波 长 下 用 1?c?m? 比 色 皿 , 试 剂 空 白 作 参 比 , 测 定 吸 光 度 .? 取 一 定 量 被 测 牛 奶 , 加 等 量 无 氨 水 稀 释 , 混 匀 后 取 5?.? 0?0?m?L? 稀 释 奶 于 干 净 试 管 中 , 再 加 入 5?.? 0?0?m?L? 脲 酶 液 , 摇 匀 后 置 3?7?C?水 浴 中 3?0?m?i?D?, 取 出 试 管 , 依 次 加 入 1?.?0?0?m?L?0?.?5?m?O?1?/? L? 硫 酸 和 1?.?0?0?m?L?1?0?%?钨 酸 钠 , 摇 匀 后 3?0?0?0?I?/? m?i?D? 转 速 下 离 心 1?0?m?i?D?, 取 离 心 后 的 上 清 液 0?.?5?0?m?L? 于 5?0?m?L? 比 色 管 中 , 按 实 验 方 法 操 作 , 测 定 吸 光 度 .? 2?结 果 与 讨 论 2?.?1?工 作 曲 线 分 别 吸 取 0?.?0?0?, 1?.?0?0?, 2?.?0?0?, 3?.?0?0?, 4?.?0?0?, 5?.?0?0?, 6?.?0?0?, 7?.?0?0?, 8?.?0?0?m?L? 氨 氮 标 准 液 于 9? 只 5?0?m?L? 比 色 管 中 , 按 实 验 方 法 操 作 , 测 定 吸 光 度 如 下 : 表 1? 标 准 管 吸 光 度 测 定 值 T?a?b?1?A?b?S?O?r?b?a?n?c?e? V?a?l?u?e?S? O?f? S?t?a?n?d?a?r?d? t?u?b?e?S? 标 准 液 用 量 ( m?L?) 0?.?0?0?1?.?0?0?2?.?0?0?3?.?0?0?4?.?0?0?5?.?0?0?6?.?0?0?7?.?0?0?8?.?0?0? 吸 光 度 ( A?) 0?0?.?0?9?2?0?.?1?8?3?0?.?2?8?1?0?.?3?7?5?0?.?4?7?0?0?.?5?6?4?0?.?6?5?4?0?.?7?4?7? 结 果 表 明 氨 氮 浓 度 在 0? ~? 0?.? 8?H?g?/? m?1? 范 围 内 符 合 比 耳 定 律 , 表 观 摩 尔 吸 光 系 数 E?7?0?0?=? 1?.? 3? X? 1?0?4?m?O?1?-? 1?.? L?.?c?m? -? 1?, 检 出 限 1?.?1? X? 1?0?-? 6?g?N? /? L?, 线 性 回 归 方 程 A? =? 0?.? 9?3?4?C?N?( u?g?/? m?L?) -? 0?.? 0?0?6?, 相 关 系 数 Y? =? 0?.?9?9?9?4? 2?.?2?显 色 剂 用 量 的 影 响 经 正 交 试 验 确 定 , 显 色 液 I?用 量 在 2?.? 2?0? ~? 2?.? 9?0?m?L?, 显 色 液 H?用 量 在 4?.? 1?0? ~? 6?.? 0?0?m?L?, 显 色 液 H? 用 量 在 4?.?4?0? ~? 5?.?5?0?m?L? 时 吸 光 度 最 大 且 稳 定 , 本 实 验 选 定 三 种 显 色 液 用 量 分 别 是 : 显 色 液 I?2?.?5?0?m?L?, 显 色 液 H?5?.?0?0?m?L?, 显 色 液 H?5?.?0?0?m?L?.? 2?.?3?不 同 脲 酶 的 影 响 选 用 刀 豆 、 黄 豆 、 绿 豆 三 种 豆 粉 , 按 1?.?1? 步 骤 制 备 三 种 酶 液 , 分 别 用 于 样 品 中 尿 素 的 酶 水 解 , 刀 豆 酶 液 2?2?m?i?D? 即 可 将 尿 素 完 全 水 解 , 黄 豆 酶 液 则 需 2?6?m?i?D?, 绿 豆 酶 液 3?0?m?i?D? 尿 素 仍 不 能 完 全 水 解 , 本 实 验 选 用 刀 豆 酶 液 , 水 解 时 间 为 3?0?m?i?D?.? 2?.?4?样 品 测 定 牛 奶 按 1?.?3? 步 骤 操 作 , 测 定 吸 光 度 后 由 线 性 回 归 方 程 计 算 出 样 品 管 的 氨 氮 浓 度 ( u?g?/? m?L?) , 按 文 献 [ 1?] , 乘 以 9?0?, 即 为 每 百 毫 升 牛 奶 中 尿 素 的 m?g? 数 , 另 外 作 纳 氏 光 度 法 测 定 ( 参 考 值 ) 及 加 标 回 收 实 验 , 结 果 如 下 : 表 2? 牛 奶 中 尿 素 含 量 测 定 结 果 T?a?b?2?D?e?t?e?r?m?i?n?a?t?i?O?n? r?e?S?u?l?t?S? O?f? u?r?e?a? i?n? m?i?l?k? 样 品 测 定 值 ( m?g?/? m?L?) !?X?参 考 值 R?S?D? ( %?) 加 入 尿 素 ( u?g? ) 回 收 值 ( u?g? ) 回 收 率 ( %?) 光 明 牌 纯 鲜 牛 奶 2?8?.?2?2?7?.?7?2?8?.?6?2?8?.?5?2?8?.?3?2?8?.?5?2?8?.?3?2?8?.?1?1?.?1?6?5?.?0?0?5?.?1?0?1?0?2? 古 城 牌 鲜 牛 奶 2?5?.?7?2?6?.?0?2?5?.?5?2?5?.?4?2?6?.?3?2?5?.?9?2?5?.?8?2?5?.?8?1?.?3?0?5?.?0?0?4?.?9?0?9?8? 卫 岗 牌 A?D? 高 钙 鲜 牛 奶 2?2?.?5?2?2?.?3?2?2?.?6?2?3?.?1?2?2?.?9?2?2?.?8?2?2?.?7?2?2?.?8?1?.?2?8?5?.?0?0?5?.?0?0?1?0?0? 参 考 文 献 : [ 1?] 王 武 生 , 石 震 强 , 王 纯 铃 , 等 .?酶 水 解 法 测 定 牛 奶 中 的 尿 素 [ J?] .? 食 品 科 学 , 1?9?9?3?, 1?6?0? ( 4?) : 5?0? ~? 5?3?.? [ 2?] 丁 伟 .?牛 奶 搀 假 快 速 测 定 [ M?] .? 太 原 : 山 西 科 学 技 术 出 版 社 , 1?9?9?3?.?1?0?7? ~? 1?1?1?.? [ 3?] 王 守 兰 , 张 艳 .?纳 氏 试 剂 分 光 光 度 法 测 定 牛 奶 中 尿 素 含 量 [ J?] .? 光 谱 实 验 室 , 1?9?9?9?, 1?6? ( 1?) : 8?5? ~? 8?7?.? [ 4?] 钱 万 英 , 余 嗣 明 .?基 础 生 化 实 验 指 导 [ M?] .?合 肥 : 安 徽 大 学 出 版 社 , 1?9?9?7?.?1?2?0? ~? 1?2?6?.? [ 5?] 李 影 林 .?中 华 医 学 检 验 全 书 : 下 卷 [ M?] .?北 京 : 人 民 卫 生 出 版 社 , 1?9?9?6?.?2?7?6?6? ~? 2?7?6?8?.? ( 下 转 第 1?6?5? 页 ) 9?5? 2?3? 卷 第 2? 期 龚 仁 敏 , 汤 勇 铮 , 王 子 建 : 酶 解 -? 水 扬 酸 盐 光 度 法 测 定 牛 奶 中 的 尿 素 I?N?V?E?S?T?I?G?A?T?I?0?N? A?N?D? 0?P?E?N?I?N?G? U?P? 0?F? T?H?E? T?0?U?R?I?S?T? M?A?R?K?E?T? I?N? T?I?A?N?M?E?N? M?0?U?N?T?A?I?N? Z?H?A?N?G? G?u?a?n?g?-?S?h?e?n?g?, Y?A?N?G? ?i?a?O?-?z?h?O?n?g?, L?U? L?i?n?, L?I?N? S?h?a?n?-?j?i?n? ( C?O?I?I?e?g?e? O?f? N?a?t?i?O?n?a?I? T?e?r?r?i?t?O?r?i?a?I? R?e?S?O?u?r?c?e?S? a?n?d? T?O?u?r?i?S?m?, A?n?h?u?i? N?O?r?m?a?I? U?n?i?v?e?r?S?i?t?y?, 2?4?l?O?O?O?, W?u?h?u?, A?n?h?u?i?, C?h?i?n?a?) A?b?S?t?r?a?c?t?: T?h?i?S? p?a?p?e?r? i?S? t?h?e? f?i?r?S?t? i?n?v?e?S?t?i?g?a?t?i?O?n? O?f? t?h?e? t?O?u?r?i?S?t? m?a?r?k?e?t? i?n? T?i?a?n?m?e?n? M?O?u?n?t?a?i?n? b?y? u?S?i?n?g? g?u?e?S?t?i?O?n?-? n?a?i?r?e?S?.? T?h?r?O?u?g?h? c?a?r?e?f?u?I? a?n?a?I?y?S?i?S? O?f? t?h?e? S?t?a?t?i?S?t?i?c?a?I? r?e?S?u?I?t?S? w?e? p?u?t? f?O?r?w?a?r?d? t?h?e? g?u?d?e?I?i?n?e?S? a?n?d? k?e?y? p?O?i?n?t?S? i?n? O?p?e?n?i?n?g? u?p? t?h?e? t?O?u?r?i?S?t? m?a?r?k?e?t? i?n? T?i?a?n?m?e?n? M?O?u?n?t?a?i?n?, p?I?a?n?S? a?r?e? m?a?d?e? O?n? t?h?e? S?O?u?r?c?e?S? O?f? t?O?u?r?i?S?t?S? a?n?d? I?i?n?e?S? O?f? t?r?a?v?e?I?I?i?n?g?.? M?e?a?S?u?r?e?S? a?r?e? a?I?S?O? p?u?t? f?O?r?w?a?r?d? c?O?n?c?e?r?n?i?n?g? t?h?e? f?u?t?u?r?e? r?e?c?I?a?m?a?t?i?O?n? O?f? t?h?e? t?O?u?r?i?S?t? M?a?r?k?e?t? i?n? T?i?a?n?m?e?n? M?O?u?n?t?a?i?n? K?e?y? w?O?r? ?S?: T?i?a?n?m?e?n? M?O?u?n?t?a?i?n?, t?O?u?r?i?S?t? m?a?r?k?e?t?, g?u?e?S?t?i?O?n?n?a?i?r?e?, O?p?e?n? u?p? !?!?!?!?!?!?!?!? ( 上 接 第 l?6?l? 页 ) D?E?T?E?R?M?I?N?A?T?I?0?N? 0?F? U?R?E?A? I?N? M?I?L?K? B?Y? E?N?Z?Y?M?0?L?Y?S?I?S?-?S?A?L?I?C?Y?L?A?T?E? S?P?E?C?T?R?0?P?H?0?T?0?M?E?T?R?Y? G?O?N?G? R?e?n?-?m?i?n?l?, T?A?N?G? Y?O?n?g?-?z?h?e?n?g?2?, W?A?N?G? Z?i?-?j?i?a?n?3? ( l?.? C?O?I?I?e?g?e? O?f? L?i?f?e? S?c?i?e?n?c?e?, A?n?h?u?i? N?O?r?m?a?I? U?n?i?v?e?r?S?i?t?y?, 2?4?l?O?O?O?, W?u?h?u?, A?n?h?u?i?, C?h?i?n?a?; 2?.? T?e?a?c?h?i?n?g? a?n?d? R?e?S?e?a?r?c?h? S?e?c?t?i?O?n? O?f? B?i?O?c?h?e?m?i?S?t?r?y?, W?a?n?n?a?n? M?e?d?i?c?a?I? C?O?I?I?e?g?e?, 2?4?l?O?O?l?, W?u?h?u?, A?n?h?u?i?, C?h?i?n?a?; 3?.? O?u?t?S?k?i?r?t?S? M?i?d?d?I?e? S?c?h?O?O?I? O?f? F?u?y?a?n?g? T?O?w?n?, 2?3?6?O?2?5?, F?u?y?a?n?g?, A?n?h?u?i?, C?h?i?n?a?) A?b?S?t?r?a?c?t?: A? n?e?w? m?e?t?h?O?d? f?O?r? d?e?t?e?r?m?i?n?a?t?i?O?n? O?f? u?r?e?a? i?n? m?i?I?k? i?S? p?r?e?S?e?n?t?e?d?.? E?X?t?r?a?t? O?f? S?w?O?r?d? b?e?a?n? p?O?w?d?e?r? a?S? u?r?e?a?S?e? c?a?t?a?I?y?z?e?S? h?y?d?r?O?I?y?S?i?S? O?f? u?r?e?a? i?n?t?O? a?m?m?O?n?i?a?, t?h?e?n? a?m?m?O?n?i?a? i?S? d?e?t?e?r?m?i?n?a?t?e?d? b?y? S?a?I?i?c?y?I?a?t?e? S?p?e?c?t?r?O?p?h?O?t?O?m?e?t?r?y?.? T?h?e? m?a?X?i?m?u?m? a?b?S?O?r?p?t?i?O?n? w?a?v?e?I?e?n?g?t?h? O?f? c?O?I?O?r?e?d? c?O?m?p?I?e?X? I?i?e?S? a?t? 7?O?O?n?m? w?i?t?h? a?p?p?a?r?e?n?t? m?O?I?a?r? a?b?S?O?r?p?t?i?O?n? c?O?e?f?f?i?c?i?e?n?t? O?f? l?.?3? X? l?O?4?m?O?I?-? l?.? L?.? c?m? -? l?, t?h?e? I?i?n?e?r? r?a?n?g?e? i?S? O? ~? O?.? 8?u?g?N? /? m?L? a?n?d? S?e?n?S?i?t?i?v?i?t?y? I?i?m?i?t? i?S? l?.? l? X? l?O? -? 6?g?N? /? L? i?n? t?h?i?S? m?e?t?h?O?d?.? K?e?y? w?O?r? ?S?: u?r?e?a?S?e?; u?r?e?a?; a?m?m?O?n?i?a?; S?a?I?i?c?y?I?a?t?e?; S?p?e?c?t?r?O?p?h?O?t?O?m?e?t?r?y? 3?6? 2?3? 卷 第 2? 期 张 光 生 , 杨 效 忠 , 陆 林 , 等 : 天 门 山 旅 游 市 场 的 调 查 与 开 拓
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