非洲爪蟾两种孵化酶分子对卵黄膜作用机制的探讨.pdf

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编号:20181206105359500223    类型:共享资源    大小:217.87KB    格式:PDF    上传时间:2019-02-16
  
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非洲爪蟾孵化酶分子对卵黄膜作用 研究.pdf 非洲爪蟾 的研究 非洲爪蟾的 PDF 非洲爪蟾孵化酶的 非洲爪蟾两种孵化酶分子对卵黄膜作用机制的探讨 的研究.pdf
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动 物 学 报 !?“? ( 3?) : 3?0?8? ~? 3?l?3?, 2?0?0?0? A?c?t?a?? Z?o?o?l?o?g?i?c?a?? S?i?n?i?c?a? 非 洲 爪 蟾 两 种 孵 化 酶 分 子 对 卵 黄 膜 作 用 机 制 的 探 讨 樊 廷 俊 ( 青 岛 海 洋 大 学 海 洋 生 命 学 院 海 洋 生 物 系 , 山 东 青 岛 2?6?6?0?0?3?) 摘 要 在 分 离 纯 化 非 洲 爪 蟾 孵 化 酶 时 , 得 到 了 6?0?k?D? 和 4?0?k?D? 两 种 分 子 , 用 孵 化 酶 的 特 异 性 抗 G?S?T?-?U?V?S?.?2? 抗 体 进 行 W?e?S?t?e?r?D? 杂 交 的 结 果 证 明 二 者 均 为 孵 化 酶 分 子 。 6?0?k?D? 分 子 很 不 稳 定 , 在 纯 化 过 程 中 极 易 降 解 , 4?0?k?D? 分 子 可 能 是 由 6?0?k?D? 分 子 经 过 降 解 或 自 身 降 解 丢 失 了 两 个 C?U?B? 重 复 区 而 形 成 的 , 而 C?U?B? 重 复 区 很 可 能 在 对 受 精 膜 分 子 结 构 的 修 饰 或 改 造 中 具 有 重 要 作 用 。 在 进 一 步 验 证 其 蛋 白 酶 活 性 和 生 物 活 性 时 , 发 现 二 者 几 乎 具 有 完 全 相 同 的 蛋 白 酶 活 性 , 而 且 均 具 有 很 强 的 卵 黄 膜 溶 解 活 性 。 这 种 卵 黄 膜 溶 解 活 性 的 结 果 暗 示 了 它 们 对 早 期 胚 胎 孵 化 进 行 调 节 的 一 个 可 能 机 制 , 即 二 者 在 降 解 受 精 膜 和 凝 胶 层 的 不 同 阶 段 相 互 配 合 、 又 各 自 扮 演 了 不 同 的 角 色 。 由 此 可 见 , 6?0?k?D? 分 子 降 解 或 自 身 降 解 为 4?0?k?D? 分 子 很 可 能 是 一 种 自 然 行 为 , 而 并 非 由 于 实 验 操 作 所 致 。 关 键 词 非 洲 爪 蟾 孵 化 酶 C?U?B? 重 复 区 卵 黄 膜 溶 解 活 性 l?9?9?8?-?0?8?-?l?8? 收 稿 , 2?0?0?0?-?0?4?-?l?6? 修 回 第 一 作 者 简 介 樊 廷 俊 , 男 , 3?5? 岁 , 理 学 博 士 , 副 教 授 。 研 究 方 向 : 细 胞 分 化 与 细 胞 工 程 。 E?-?m?a?i?1?: t? ?f?a?D?@? O?u?g?c?.?e?c?u?.?c?D? 非 洲 爪 蟾 ( X?e?n?o?p?u?s? l?a?e?1?i?s?) 早 期 胚 胎 的 孵 化 是 借 助 于 由 胚 胎 产 生 的 孵 化 酶 ( 1?a?t?c?1?i?D?g? e?D?Z?y?m?e?, H?E?) 和 胚 胎 自 身 的 肌 肉 运 动 来 完 成 的 ( Y?O?S?1?i?Z?a?k?i?, l?9?9?l?) 。 l?9?9?6? 年 , 作 者 等 在 对 非 洲 爪 蟾 孵 化 酶 进 行 分 离 纯 化 时 , 得 到 了 6?0?k?D? 和 4?0?k?D? 两 种 分 子 , 并 首 次 证 明 二 者 均 为 孵 化 酶 分 子 ( F?a?D? e?t? a?l?.?, l?9?9?7?; 樊 廷 俊 等 , l?9?9?8?) 。 经 测 定 , 6?0?k?D? 分 子 具 有 很 强 的 卵 黄 膜 溶 解 活 性 , 而 4?0?k?D? 分 子 没 有 卵 黄 膜 溶 解 活 性 , 尽 管 二 者 对 二 甲 酪 基 蛋 白 和 丁 氧 羧 基 -?亮 氨 酸 -?甘 氨 酸 -?精 氨 酸 -?甲 基 氧 杂 萘 邻 酮 酰 胺 ( t?-?b?u?t?y?1?O?D?y?c?a?r?b?O?D?y?1?-?1?e?u?c?i?D?e?-?g?1?y?c?i?D?e?-?a?r?g?i?D?i?D?e?-?4?-? m?O?t?1?y?1? c?O?u?m?a?r?y?1?-?7?-?a?m?i?c?e?, B?O?c?-?L?e?u?-?G?1?y?-?A?r?g?-?M?C?A?) 均 具 有 很 高 的 蛋 白 酶 活 性 。 因 此 得 出 4?0?k?D?分 子 之 所 以 没 有 卵 黄 膜 溶 解 活 性 是 因 为 不 具 有 补 体 亚 组 分 C?U?B?( C?i?r?/?C?i?S?, U?e?g?f?, B?m?p?l?) 重 复 区 , 而 C?U?B? 重 复 区 在 对 卵 黄 膜 的 识 别 或 加 工 修 饰 中 具 有 重 要 作 用 的 结 论 ; 同 时 也 认 为 6?0?k?D? 分 子 降 解 或 自 身 降 解 为 4?0?k?D? 分 子 很 可 能 是 由 于 实 验 操 作 所 致 。 因 所 用 孵 化 酶 样 品 纯 度 较 低 , 所 得 结 果 仍 需 进 一 步 进 行 验 证 。 l?9?9?7? 年 , 片 桐 千 明 等 在 非 洲 爪 蟾 第 2?5? 期 胚 胎 头 背 部 克 隆 出 了 孵 化 酶 基 因 , 在 其 推 测 蛋 白 质 一 级 结 构 中 具 有 两 个 C?U?B? 重 复 区 , 也 认 为 C?U?B? 重 复 区 可 能 在 对 卵 黄 膜 的 识 别 或 加 工 修 饰 中 有 重 要 作 用 , 而 4?0?k?D? 分 子 之 所 以 没 有 卵 黄 膜 溶 解 活 性 是 因 为 没 有 C?U?B? 重 复 区 ( K?a?t?a?g?i?r?i? e?t? a?l?.?, l?9?9?7?) 。 本 文 通 过 对 孵 化 酶 进 行 进 一 步 纯 化 , 获 得 了 纯 度 极 高 的 孵 化 酶 样 品 。 在 进 一 步 验 证 其 蛋 白 酶 活 性 和 生 物 活 性 时 , 发 现 4?0?k?D? 分 子 既 具 有 很 强 的 蛋 白 酶 活 性 , 对 未 受 精 卵 的 卵 黄 膜 也 具 有 较 强 的 卵 黄 膜 溶 解 活 性 。 由 此 , 作 者 提 出 了 一 个 关 于 6?0?k?D? 和 4?0?k?D? 孵 化 酶 分 子 在 结 构 和 功 能 关 系 上 的 新 观 点 。 1?材 料 和 方 法 1?.?1?材 料 和 试 剂 雌 、 雄 非 洲 爪 蟾 由 本 实 验 室 人 工 饲 养 。 兔 抗 G?S?T?-?U?V?S?.?2? 抗 体 由 本 实 验 室 制 备 ; S?u?p?e?r?c?e?X? 7?5? H?R? l?0?/? 3?0? 凝 胶 过 滤 柱 , M?O?D?O? O? H?R? 5?/?5? 阴 离 子 交 换 柱 ( p?1?a?r?m?a?c?i?a?) ; 纤 维 素 转 移 膜 ( i?m?m?O?b?i?1?O?D?-?P?, M?i?1?1?i?p?O?r?e?) ; B?O?c?-?L?e?u?-?G?1?y?-?A?r?g?-?M?C?A?( 日 本 多 肽 研 究 所 ) ; 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的 羊 抗 兔 I?g?G?( H? +? L?) ( Z?y?m?e?c?) 。 所 用 化 学 试 剂 均 为 分 析 纯 。 1?.?2?胚 胎 的 获 得 、 孵 化 液 的 制 备 和 酶 的 纯 化 参 照 前 文 的 方 法 ( 樊 廷 俊 等 , l?9?9?8?) 。 S?u?p?e?r?c?e?X? 7?5? 凝 胶 过 滤 样 品 再 次 上 样 于 S?u?p?e?r?c?e?X? 7?5? 柱 , 所 得 样 品 作 为 S?u?p?e?r?c?e?X? 7?5? 纯 化 样 品 使 用 ; 第 2? 次 S?u?p?e?r?c?e?X? 7?5? 纯 化 样 品 再 经 M?O?D?O? O? 阴 离 子 交 换 后 , 便 作 为 M?O?D?O? O? 纯 化 样 品 使 用 。 1?.?3?W?e?S?t?e?r?n? 杂 交 S?D?S?-?P?A?G?E? 参 照 L?a?e?m?m?1?i?( l?9?7?l?) 的 方 法 。 W?e?S?t?e?r?D? 杂 交 使 用 非 洲 爪 蟾 孵 化 酶 的 特 异 性 抗 G?S?T?-?U?V?S?.?2? 抗 体 , 方 法 参 照 K?a?t?a?g?i?r?i? 等 ( l?9?9?7?) 的 方 法 。 电 泳 分 离 后 的 蛋 白 质 转 移 至 一 张 纤 维 素 膜 上 , 用 5?%?脱 脂 奶 粉 在 4?C?封 闭 过 夜 后 , 将 膜 用 l?1?l? 0?0?0? 抗 G?S?T?-?U?V?S?.?2? 抗 体 和 l?1?5?0?0? 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的 羊 抗 兔 I?g?G? ( H?+? L?) 孵 育 处 理 后 , 在 B?C?I?P?/?N?B?T? 磷 酸 酶 显 色 系 统 中 进 行 显 色 。 图 1? 孵 化 酶 粗 品 的 S?u?p?e?r?d?e?x? 7?5? 凝 胶 过 滤 柱 层 析 F?i?g?.?1?F?r?a?c?t?i?O?n?a?t?i?O?n? O?f? c?r?u?d?e? h?a?t?c?h?i?n?g? e?n?z?y?m?e? O?n? S?u?p?e?r?d?e?x? 7?5? c?O?l?u?m?n? 对 B?O?c?-?L?e?u?-?G?1?y?-?A?r?g?-?M?C?A? 具 有 高 酶 活 性 的 峰 值 组 分 为 第 l?9? ~? 2?4? 号 组 分 , 将 其 收 集 后 进 行 W?e?S?t?e?r?D? 杂 交 , 结 果 见 图 3? ( F?r?a?c?t?i?O?D?S? w?i?t?1? 1?i?g?1? p?r?O?t?e?O?1?y?t?i?c? a?c?t?i?V?i?t?i?e?S? O?D? B?O?c?-?L?e?u?-?G?1?y?-?A?r?g?-?M?C?A? w?e?r?e? f?r?a?c?t?i?O?D? l?9? ~? 2?4?.? T?1?e?y? w?e?r?e? p?O?O?1?e?c? t?O?g?e?t?1?e?r?, a?D?c? t?1?e?i?r? W?e?S?t?e?r?D? b?1?O?t? i?S? S?1?O?w?D? i?D? F?i?g?.?3?) 1?.?4?各 种 孵 化 酶 样 品 的 卵 黄 膜 溶 解 活 性 分 析 经 人 绒 毛 膜 促 性 腺 激 素 ( 1?u?m?a?D? c?1?O?r?i?O?D?i?c? g?O?D?a?c?O?t?r?O?p?i?D?, 1?C?G?) 诱 导 所 得 成 熟 卵 , 用 2?.?5?%?硫 糖 酸 钠 ( S?O?c?i?u?m? t?1?i?O?g?1?y?c?O?1?a?t?e?) 消 化 3? 分 钟 脱 去 胶 层 后 , 在 解 剖 镜 下 挑 选 出 动 物 极 白 斑 向 上 的 活 卵 ( 即 无 胶 膜 未 受 精 卵 ) ; 将 0?.?3?m?1? 孵 化 酶 样 品 ( l? 0?0?0?胚 胎 /?m?L?) 注 入 铺 有 琼 脂 的 2?4? 孔 培 养 板 孔 中 , 加 入 6? 个 无 胶 膜 未 受 精 卵 , 于 2?5?C?摇 床 中 孵 育 , 每 隔 l?0? 分 钟 观 察 一 次 , 记 录 卵 黄 膜 被 溶 解 的 时 间 和 个 数 。 1?.?5?孵 化 酶 样 品 的 蛋 白 酶 活 性 测 定 取 2?0?!?1? 酶 品 加 入 2?0?!?1? 5?0?!?m?O?1?/?L? B?O?c?-?L?e?u?-?G?1?y?-?A?r?g?-?M?C?A? 底 物 溶 液 ( 溶 于 5?0?m?m?O?1?/?L? H?e?p?-? e?S?-?N?a?0?H?, p?H?7?.?4?) , 室 温 下 反 应 3?0? 分 钟 后 加 入 l?.?5?m?1? 冰 冷 水 以 终 止 反 应 , 待 温 度 恢 复 至 室 温 后 , 利 用 荧 光 光 度 计 进 行 荧 光 测 定 ( 激 发 波 长 , 3?8?0?D?m?; 发 射 波 长 , 4?6?0?D?m?; 狭 缝 , 4?; P?M? G?A?I?N?, 正 常 ) 。 2?结 果 2?.?1?酶 的 纯 化 用 S?u?p?e?r?c?e?X? 7?5? 柱 对 孵 化 酶 粗 品 进 行 凝 胶 过 9?0?3?3? 期 樊 廷 俊 : 非 洲 爪 蟾 两 种 孵 化 酶 分 子 对 卵 黄 膜 作 用 机 制 的 探 讨 图 2? S?l?p?e?r?d?e?X? 7?5? 孵 化 酶 组 分 的 M?O?n?O? 0? 阴 离 子 交 换 柱 层 析 F?i?g?.?2?F?r?a?c?t?i?O?n?a?t?i?O?n? O?f? S?l?p?e?r?d?e?X? 7?5? f?r?a?c?t?i?O?n? b?y? M?O?n?O? 0? i?O?n?-?e?X?c?h?a?n?g?e? c?h?r?O?m?a?t?O?g?r?a?p?h?y? 对 B?O?c?-?L?e?u?-?G?1?y?-?A?r?g?-?M?C?A? 具 有 高 酶 活 性 的 峰 值 组 分 收 集 ( 第 8? ~? l?l? 号 组 分 ) , 其 W?e?S?t?e?r?H? 杂 交 结 果 见 图 3? [ F?r?a?c?t?i?O?H?S? w?i?t?1? 1?i?g?1? p?r?O?t?e?O?1?y?t?i?c? a?c?t?i?V?i?t?i?e?S? O?H? B?O?c?-?L?e?u?-?G?1?y?-?A?r?g?-?M?C?A? w?e?r?e? p?O?O?1?e?c? i?H? g?r?O?u?p?( f?r?a?.? 8? ~? l?l?) .? W?e?S?t?e?r?H? b?1?O?t? O?f? i?t? i?S? S?1?O?w?H? i?H? F?i?g?.?3?] 滤 , 得 到 对 5?0?!?m?O?1?/?L? B?O?c?-?L?e?u?-?G?1?y?-?A?r?g?-?M?C?A?有 高 酶 活 性 的 峰 值 组 分 ( 图 l?) 。 经 W?e?S?t?e?r?H? 杂 交 和 卵 黄 膜 溶 解 活 性 测 定 , 只 有 峰 “?和 峰 #?含 有 6?0?k?D? 和 4?0?k?D? 两 种 阳 性 孵 化 酶 分 子 ( 图 3?: A?) , 且 具 有 卵 黄 膜 溶 解 活 性 ( 表 l?) 。 用 M?O?H?O? O? 柱 进 行 阴 离 子 交 换 时 , B?O?c?-?L?e?u?-? G?1?y?-?A?r?g?-?M?C?A? 的 最 高 酶 活 性 位 于 0?.?l? ~? 0?.?2? m?O?1?/?L? N?a?C?1? 的 洗 脱 组 分 中 。 得 到 的 高 酶 活 性 的 峰 值 组 分 ( 图 2?) , 经 W?e?S?t?e?r?H? 杂 交 和 卵 黄 膜 溶 解 活 性 测 定 , 只 有 峰 $?含 有 4?0?k?D? 孵 化 酶 分 子 ( 图 3?: B?) , 且 具 有 卵 黄 膜 溶 解 活 性 ( 表 l?) 。 2?.?2?W?e?S?t?e?r?n? 杂 交 孵 化 酶 粗 品 中 含 有 一 分 子 量 6?0?k?D? 的 孵 化 酶 分 子 , 有 时 也 含 有 4?0?k?D? 孵 化 酶 分 子 ; 6?7? ?饱 和 硫 酸 铵 沉 淀 样 品 和 S?u?p?e?r?c?e?X? 7?5? 纯 化 样 品 中 同 时 含 有 6?0?k?D? 和 4?0?k?D? 两 种 孵 化 酶 分 子 , 而 M?O?H?O? O? 纯 化 样 品 中 只 含 有 一 种 4?0?k?D? 孵 化 酶 分 子 ( 图 3?) 。 图 3? 孵 化 酶 不 同 纯 化 样 品 的 W?e?S?t?e?r?n? 杂 交 F?i?g?.?3?W?e?S?t?e?r?n? b?l?O?t?t?i?n?g? O?f? t?h?e? d?i?f?f?e?r?e?n?t? p?l?r?i?f?i?e?d? h?a?t?c?h?i?n?g? e?n?z?y?m?e? 所 用 一 抗 为 非 洲 爪 蟾 孵 化 酶 的 特 异 性 抗 G?S?T?-?U?V?S?.? 2? 抗 体 。 P?M?, S?D?S? 电 泳 用 标 准 分 子 量 蛋 白 , 其 分 子 量 ( k?D?) 如 图 左 所 示 [ T?1?e? A?b?l? u?S?e?c? w?a?S? t?1?e? S?p?e?c?i?f?i?c? a?H?t?i? G?S?T?-?U?V?S?.?2? a?H?t?i?b?O?c?y? O?f? X?e?n?o?p?u?s? 1?a?t?c?1?i?H?g? e?H?Z?y?m?e?.? P?M?, p?r?e?S?t?a?i?H?e?c? S?D?S? S?t?a?H?-? c?a?r?c?S? w?i?t?1? M?W?S?( k?D?) i?H?c?i?c?a?t?e?c? i?H? t?1?e? 1?e?f?t? O?f? t?1?e? f?i?g?u?r?e?] A?: 孵 化 酶 粗 品 ( C?r?u?c?e? 1?a?t?c?1?i?H?g? e?H?Z?y?m?e?) B?: 6?7? ? 饱 和 硫 酸 铵 沉 淀 样 品 ( 6?7? ? a?m?m?O?H?i?a? S?u?1?f?a?t?e? p?r?e?c?i?p?i?t?a?t?i?O?H?) C?: S?u?p?e?r?c?e?X? 7?5?$?组 分 ( S?u?p?e?r?c?e?X? 7?5?$?f?r?a?c?t?i?O?H?) D?: M?O?H?O? O? 组 分 ( M?O?H?O? O? f?r?a?c?t?i?O?H?) 0?l?3? 动 物 学 报 4?6? 卷 2?.?3?卵 黄 膜 溶 解 活 性 分 析 浓 度 为 l? 0?0?0? 胚 胎 /?m?1? 的 孵 化 酶 粗 品 、 6?7?%?S?A?S? 沉 淀 样 品 和 S?u?p?e?r?c?e?X? 7?5? 纯 化 样 品 均 可 在 l?5? ~? 2?0? 分 钟 内 使 卵 黄 膜 发 生 膨 胀 , 在 5?0? ~? 6?0? 分 钟 内 将 卵 黄 膜 完 全 溶 解 , 具 有 很 强 的 卵 黄 膜 溶 解 活 性 ; M?O?H?O? O? 纯 化 样 品 也 具 有 很 强 的 卵 黄 膜 溶 解 活 性 。 经 过 多 次 验 证 , 它 也 能 在 6?0? 分 钟 完 全 溶 解 ( 表 l?) 。 表 1? 不 同 孵 化 酶 样 品 的 蛋 白 酶 活 性 和 卵 黄 膜 溶 解 活 性 T?a?b?l?e? 1?P?r?O?t?e?O?l?y?t?i?c? a?n?d? V?E?-?S?O?l?u?b?i?l?i?z?i?n?g? a?c?t?i?V?i?t?i?e?S? O?f? d?i?f?f?e?r?e?n?t? h?a?t?c?h?i?n?g? e?n?z?y?m?e? p?r?e?p?a?r?a?t?i?O?n?S? 孵 化 酶 样 品 !? H?E? p?r?e?p?a?r?a?t?i?O?H?S? 卵 黄 膜 被 溶 解 的 卵 数 与 所 需 分 钟 数 N?u?m?b?e?r? O?f? e?g?g?S? w?i?t?1? V?E?-?S?O?1?u?b?i?1?i?Z?e?c? a?t? m?i?H? 2?0?3?0?4?0?5?0?6?0? 蛋 白 酶 活 性 !? !? P?r?O?t?e?O?1?y?t?i?c? a?c?t?i?V?i?t?y? ( H?m?O?1?/?L? A?M?C?/?m?i?H?) 孵 化 酶 粗 品 ( C?r?u?c?e? H?E?) 0?3?5?6?l?2?6? 6?7?%? S?A?S? 沉 淀 样 品 !? !? !? ( P?r?e?c?i?p?i?t?a?t?i?O?H?S? O?f? 6?7?%? S?A?S?) 0?3?4?6?l?3?2? S?u?p?e?r?c?e?X? 7?5?!?组 分 ( S?u?p?e?r?c?e?X? 7?5?!?f?r?a?c?t?i?O?H?S?) 0?3?5?6?l?0?2? M?O?H?O? O? 组 分 ( M?O?H?O? O? f?r?a?c?t?i?O?H?S?) 0?2?3?5?6?9?8?.?3? !?每 种 孵 化 酶 样 品 的 浓 度 为 l? 0?0?0? 胚 胎 /?m?1?; S?u?p?e?r?c?e?X? 7?5?!?组 分 为 第 二 次 S?u?p?e?r?c?e?X? 7?5? 凝 胶 过 滤 回 收 组 分 ( T?1?e? c?O?H?-? c?e?H?t?r?a?t?i?O?H? O?f? e?a?c?1? 1?a?t?c?1?i?H?g? e?H?Z?y?m?e? p?r?e?p?a?r?a?t?i?O?H? i?S? l?0?0?0? e?m?b?r?y?O?S?/?m?1?.? S?u?p?e?r?c?e?X? 7?5?!?f?r?a?c?t?i?O?H? w?a?S? c?O?1?1?e?c?t?e?c? f?r?O?m? t?1?e? 2?H?c? S?u?p?e?r?c?e?X? 7?5? g?e?1?-?f?i?1?t?r?a?t?i?O?H?) !? !?所 用 底 物 为 5?0?“?m?O?1?/?L? B?O?c?-?L?e?u?-?G?1?y?-?A?r?g?-?M?C?A?( 5?0?“?m?O?1?/?L? B?O?c?-?L?e?u?-?G?1?y?-?A?r?g?-?M?C?A? w?a?S? u?S?e?c? a?S? t?1?e? S?u?b?S?t?r?a?t?e?) !? !? !?S?A?S?, 饱 和 硫 酸 铵 ( S?A?S?, S?a?t?u?r?a?t?i?O?H? O?f? a?m?m?O?H?i?O?H? S?u?1?f?a?t?e?) 3?讨 论 l?9?9?7? 年 , 作 者 等 发 现 6?0?k?D? 非 洲 爪 蟾 孵 化 酶 分 子 很 不 稳 定 , 在 纯 化 操 作 过 程 中 , 极 易 降 解 为 4?0?k?D? 分 子 , 并 认 为 4?0?k?D? 孵 化 酶 分 子 是 由 6?0?k?D? 孵 化 酶 分 子 在 纯 化 操 作 过 程 中 发 生 降 解 或 自 身 降 解 后 所 形 成 的 ( F?a?H? e?t? a?l?.?, l?9?9?7?; 樊 廷 俊 等 , l?9?9?8?) 。 同 年 K?a?t?a?g?i?r?i? 等 又 克 隆 出 了 非 洲 爪 蟾 孵 化 酶 的 全 长 c?D?N?A? 序 列 。 该 基 因 含 有 一 个 编 码 5?l?4? 个 氨 基 酸 的 可 读 架 ; 其 编 码 蛋 白 为 一 种 前 原 酶 , 在 其 推 测 出 的 蛋 白 质 一 级 结 构 中 , 含 有 一 个 信 号 肽 序 列 、 一 个 原 酶 序 列 和 一 个 4?2?5? 个 氨 基 酸 的 成 熟 酶 , 成 熟 酶 又 包 括 一 个 属 于 A?S?t?a?c?i?H? 家 族 的 锌 -?金 属 蛋 白 酶 主 功 能 区 和 两 个 C?U?B? 重 复 区 ( K?a?t?a?g?i?r?i? e?t? a?l?.?, l?9?9?7?) 。 由 此 , 作 者 等 认 为 C?U?B? 重 复 区 可 能 在 对 卵 黄 膜 分 子 结 构 的 识 别 、 改 造 或 加 工 修 饰 中 具 有 重 要 作 用 , 4?0?k?D?孵 化 酶 分 子 之 所 以 没 有 卵 黄 膜 溶 解 活 性 可 能 是 因 为 缺 少 了 C?U?B? 重 复 区 ( F?a?H? e?t? a?l?.?, l?9?9?7?; 樊 廷 俊 等 , l?9?9?8?) 。 两 个 C?U?B? 重 复 区 位 于 金 属 蛋 白 酶 主 功 能 区 的 C?-?末 端 , 大 小 各 为 l?l?0? 个 氨 基 酸 , 其 推 测 分 子 量 约 为 2?0?k?D? 左 右 , 因 此 认 为 4?0?k?D? 分 子 只 是 6?0?k?D? 分 子 在 纯 化 操 作 过 程 中 降 解 或 自 身 降 解 后 所 残 留 下 的 N?-?末 端 的 一 个 蛋 白 酶 功 能 区 。 并 且 认 为 , 6?0?k?D? 分 子 降 解 成 4?0?k?D? 分 子 是 由 于 实 验 操 作 所 致 , 是 一 种 人 为 的 现 象 , 而 并 非 是 一 种 自 然 行 为 ( 樊 廷 俊 等 , l?9?9?8?) 。 l?l?3?3? 期 樊 廷 俊 : 非 洲 爪 蟾 两 种 孵 化 酶 分 子 对 卵 黄 膜 作 用 机 制 的 探 讨 既 然 4?0?k?D? 分 子 是 6?0?k?D? 分 子 在 实 验 操 作 过 程 中 降 解 或 自 身 降 解 所 形 成 的 , 又 没 有 卵 黄 膜 溶 解 活 性 , 为 了 验 证 4?0?k?D? 分 子 是 否 只 是 一 种 人 为 产 物 以 及 它 有 没 有 生 物 学 价 值 , 作 者 又 使 用 了 各 种 方 法 对 6?0?k?D? 孵 化 酶 分 子 进 行 处 理 , 包 括 4?C?和 室 温 分 别 放 置 、 向 其 缓 冲 液 中 添 加 Z?n?2? +?或 C?a?2? +?或 E?D?T?A?、 E?G?T?A? 等 , 发 现 它 总 是 有 一 部 分 要 变 成 4?0?k?D? 分 子 ( 结 果 未 发 表 ) 。 各 种 结 果 表 明 , 6?0?k?D? 孵 化 酶 分 子 降 解 成 4?0?k?D? 分 子 很 可 能 是 一 种 自 然 形 为 , 并 非 是 由 于 实 验 操 作 所 致 。 与 前 文 相 比 , 作 者 对 卵 黄 膜 溶 解 活 性 分 析 的 实 验 条 件 作 了 如 下 改 进 : ( l?) 在 纯 化 时 先 进 行 两 次 凝 胶 过 滤 后 再 进 行 阴 离 子 交 换 柱 层 析 , 所 用 孵 化 酶 比 前 文 更 纯 , 以 排 除 其 它 杂 蛋 白 的 干 扰 ; ( 2?) 无 胶 膜 未 受 精 卵 进 行 了 严 格 挑 选 , 只 使 用 动 物 极 白 斑 向 上 的 活 未 受 精 卵 , 以 排 除 因 卵 质 量 不 佳 而 带 来 的 影 响 ; ( 3?) 孵 育 液 使 用 p?~? 值 为 7?.?7?5?( 非 洲 爪 蟾 孵 化 酶 的 最 适 p?~? 值 ) 的 5?0?m?m?O?I?/?L? ~?e?p?e?S?-?N?a?O?~? 缓 冲 液 , 替 代 了 前 文 中 的 D?e? B?O?a?r? 溶 液 ( p?~?7?.?4?) , 以 期 使 酶 发 挥 出 其 最 大 活 性 ; ( 4?) 在 利 用 2?.?5?%?硫 糖 酸 钠 脱 去 胶 层 时 , 消 化 时 间 由 2? 分 钟 延 长 为 3? 分 钟 , 以 排 除 因 残 留 有 少 量 凝 胶 层 而 对 酶 发 挥 降 解 活 性 的 影 响 ; ( 5?) 孵 育 过 程 在 2?5?C?摇 床 中 进 行 , 而 非 以 前 的 静 置 孵 育 , 以 便 使 酶 分 子 与 底 物 能 充 分 接 触 从 而 提 高 酶 的 降 解 效 果 。 在 此 改 进 的 实 验 条 件 下 , 发 现 4?0?k?D? 分 子 也 具 有 很 强 的 卵 黄 膜 溶 解 活 性 。 作 者 认 为 , 在 脱 去 胶 膜 时 , 2?.?5?%?硫 糖 酸 钠 对 未 受 精 卵 消 化 时 间 的 延 长 , 可 能 会 降 解 掉 卵 黄 膜 表 面 的 部 分 结 构 成 分 , 从 而 使 得 4?0?k?D? 分 子 降 解 卵 黄 膜 成 为 可 能 。 在 严 格 控 制 的 上 述 实 验 条 件 下 进 行 了 多 次 验 证 , 所 得 结 果 均 完 全 一 致 。 由 此 , 本 文 提 出 了 一 个 关 于 6?0?k?D? 和 4?0?k?D? 孵 化 酶 分 子 在 孵 化 过 程 中 各 自 扮 演 着 不 同 角 色 的 新 观 点 。 非 洲 爪 蟾 孵 化 酶 分 子 是 早 期 胚 胎 在 孵 化 前 后 的 特 定 阶 段 、 根 据 胚 胎 进 一 步 发 育 的 需 要 所 产 生 和 分 泌 出 的 一 种 能 部 分 降 解 受 精 膜 和 部 分 凝 胶 层 的 蛋 白 酶 。 该 酶 作 用 单 一 , 只 在 早 期 胚 胎 孵 化 时 起 决 定 性 作 用 ( Y?O?S?h?i?z?a?k?i?, l?9?9?l?) 。 作 者 认 为 , 在 降 解 受 精 膜 和 凝 胶 层 的 起 始 阶 段 , 6?0?k?D? 孵 化 酶 分 子 起 着 关 键 性 作 用 , 通 过 其 中 的 C?U?B? 重 复 区 对 卵 黄 膜 分 子 结 构 的 识 别 或 修 饰 而 起 始 对 受 精 膜 和 部 分 凝 胶 层 的 降 解 。 此 降 解 作 用 一 旦 启 动 , 便 主 要 是 蛋 白 酶 降 解 活 性 在 起 作 用 。 因 此 , 仅 靠 4?0?k?D? 孵 化 酶 分 子 便 可 完 成 , C?U?B? 重 复 区 已 无 存 在 的 必 要 。 此 外 , C?U?B? 重 复 区 的 存 在 在 三 维 构 象 上 对 蛋 白 酶 活 性 的 发 挥 还 会 有 所 干 扰 , 只 有 去 除 C?U?B? 重 复 区 , 4?0?k?D? 孵 化 酶 分 子 才 能 最 大 限 度 地 发 挥 蛋 白 酶 的 降 解 活 性 。 因 此 , 在 完 成 对 受 精 膜 和 部 分 凝 胶 层 降 解 的 起 动 后 , 6?0?k?D? 化 酶 分 子 便 通 过 一 定 的 机 制 自 动 降 解 为 4?0?k?D? 分 子 , 以 便 更 有 效 地 降 解 受 精 膜 和 部 分 凝 胶 层 , 进 而 完 成 胚 胎 的 孵 化 。 综 上 所 述 , 作 者 认 为 6?0?k?D? 孵 化 酶 分 子 降 解 为 4?0?k?D? 孵 化 酶 分 子 是 一 种 自 然 行 为 , 是 为 了 更 快 地 完 成 胚 胎 的 孵 化 , 而 并 非 由 于 实 验 操 作 所 致 ; 二 者 在 降 解 受 精 膜 和 凝 胶 层 的 不 同 阶 段 相 互 配 合 , 各 自 扮 演 了 不 同 的 角 色 。 参 考 文 献 ( R?e?f?e?r?e?n?c?e?s?) C?a?r?r?O?I?I?, E?.? J?.? a?n?d? J?.? L?.? ~?e?d?r?i?c?k? l?9?7?4?~?a?t?c?h?i?n?g? i?n? t?h?e? t?O?a?d? X?e?I?O?p?U?S? l?a?e?1?i?S?: m?O?r?p?h?O?I?O?g?i?c?a?I? e?v?e?n?t?S? a?n?d? e?v?i?d?e?n?c?e? f?O?r? a? h?a?t?c?h?i?n?g? e?n?z?y?m?e?.? D?e?1?.? B?i?O?l?.? 3?8?: l? ~? l?3?.? F?a?n?, T?.? J?.? a?n?d? C?.? K?a?t?a?g?i?r?i? l?9?9?8?P?u?r?i?f?i?c?a?t?i?O?n? a?n?d? S?O?m?e? b?i?O?c?h?e?m?i?c?a?I? S?p?e?c?i?f?i?c?i?t?y? S?t?u?d?i?e?S? O?f? h?a?t?c?h?i?n?g? e?n?z?y?m?e? f?r?O?m? X?e?I?O?p?U?S? l?a?e?1?i?S?.? A?c?t?a? B?i?O?c?h?i?m?i?c?a? e?t? B?i?O?p?h?y?S?i?c?a? S?i?I?i?c?a? 3?0?( l?) : 7?5? ~? 8?0?.?[ 樊 廷 俊 , 片 桐 千 明 l?9?9?8?非 洲 爪 蟾 孵 化 酶 的 分 离 纯 化 及 其 部 分 生 化 特 性 研 究 .? 生 物 化 学 与 生 物 物 理 学 报 3?0?( l?) : 7?5? ~? 8?0?.?] 2?l?3? 动 物 学 报 4?6? 卷 F?a?H?, T?.? J?.? a?H?c? C?.? K?a?t?a?g?i?r?i? l?9?9?7?T?1?e? m?O?c?e? O?f? a?c?t?i?O?H? O?H? V?i?t?e?1?1?i?H?e? e?H?V?e?1?O?p?e? O?f? X?e?I?O?p?U?S? 1?a?t?c?1?i?H?g? e?H?Z?y?m?e? a?S? r?e?V?e?a?1?e?c? b?y? i?t?S? t?w?O? m?O?1?e?c?u?1?a?r? f?O?r?m?S?.? Z?O?O?l?.? S?c?i?.? l?4?( l?) : l?0?l? ~? l?0?4?.? G?r?e?y?, R?.? D?.?, D?.? P?.? W?O?1?f? a?H?c? J?.? L?.? H?e?c?r?i?c?k? l?9?7?4?F?O?r?m?a?t?i?O?H? a?H?c? S?t?r?u?c?t?u?r?e? O?f? t?1?e? f?e?r?t?i?1?i?Z?a?t?i?O?H? e?H?V?e?1?O?p?e? i?H? X?e?I?O?p?U?S? l?a?e?1?i?S?.? D?e?1?.? B?i?O?l?.? 3?6?: 4?4? ~? 6?l?.? K?a?t?a?g?i?r?i?, C?.?, R?.? M?a?e?c?a?, C?.? Y?a?m?a?S?i?k?a?, K?.? M?i?t?a?, T?.? D?.? S?a?r?g?e?H?t? a?H?c? S?.? Y?a?S?u?m?a?S?u? l?9?9?7?M?O?1?e?c?u?1?a?r? c?1?O?H?i?H?g? O?f? X?e?I?O?p?U?S? 1?a?t?c?1?-? i?H?g? e?H?Z?y?m?e? a?H?c? i?t?S? S?p?e?c?i?f?i?c? e?X?p?r?e?S?S?i?O?H? i?H? 1?a?t?c?1?i?H?g? g?1?a?H?c? c?e?1?1?S?.? I?I?t?e?r?I?.? ?.? D?e?1?e?l?O?p?.? B?i?O?l?.? 4?1?: 3?7? ~? 4?l?.? L?a?e?m?m?1?i?, U?.? K?.?l?9?7?0? C?1?e?a?V?e?a?g?e? O?f? S?t?r?u?c?t?u?
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