压力对体外培养的牛角膜内皮细胞的影响.pdf

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角膜内皮细胞 角膜内皮细胞的 影响角膜 角膜内皮细胞体外培养的 对角膜内皮细胞 的影响 角膜内皮细胞培养 的牛角膜内皮细胞 角膜内皮 内皮细胞的影响 对体外培养的 对角膜内皮细胞的 角膜内皮细胞对
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第lo卷第6期 眼 视 光 学 杂 志 v01.10 No.6 2008年l 1月 Chinese JoumaJ of 0pIometry&Ophthalrnology NoV.20()8 压力对体外培养的牛角膜内皮细胞的影响 黄渝侃,张明昌,范可顺,张光红 华巾科技大学同济医学院附属协和医院眼科。湖北武汉430022 The effects of pressure on cultured bovine corneal endothelial cells in vitro HUANG Yukan,ZHANG M-ngchang,FAN Keshun,et al- Dep∞却T沈n|《Ophthalmo幻gy.Union Hospaal A承l池ed to %,珂i Med记以c0抛舻,H眦^o_rlg‰西e邢砂矿sc如,zce帆d 死c^加厶研,形以帆傩渤,430022 [Abstract] objectiVe 7ro e。plore whetller the exposure of bovine comeal endothelial ceUs to pressure stress in、,in_o cau∞s changes in cellular morphology and cell viabiIity.Methods Cultured bovine comeal endothelIal cells were incubated in a p他ssuri跹d challl:ber砒 2.67 kPa,5.33 kPa and 8.00 kPa for 6,12,24,36 and 48 h. Contml cen8 were incubated at atmospheric pre88ure.The mo巾ho】o. gy of the cells w鹊 inve8tigated using an inverted ph器e contrast microscope and electmn microscope.The viability 0f the cells w器 assessed by me嬲uri“g with Trypan blue staini“g in response to e1一 eVated pre88ure for 48 h.7rhe dif伯rences in Trypan blue staining of positiVe cells at difkrent pressure conditions when compared at 48 h we陀evaluated by a one—way ANOVA.R髑ul协 CeU morphology did not change following唧08ure to 2.67 kPa (1 kPa=7.5 mmHg) pres8ure f缸6, 12,24,36粕d 48 h.There were no statistical differences in TrypaIl blue s嘲ning 0f positive cells for di‰rent pressure conditions at 2.67 kPa for 48 h(P=O.776).Cell8 subjected to 5.33 kPa for 24 h demonstrated cell damage characte打zed by morpholo舀cal cha“ges and the number of damaged cells further in— cre鹊ed at 36 h and 48 h.A si弘ific彻t rnorphological diff毫rence w鹊observed under 8.oo kPa pres8ure at 6 h and further increased in a tjme and pressure—d。pendent manner.There were statistical diffbrences in‘I’呻arI blue scaini“g of positive cells when pressure conditi咖we陀compared at 5.33 kPa and 8加kPa for 48 h (P- 0.0001.Conclusion rnle∞observations demonstrate that the exter- nal pressure limit for bovine c咖eal endothelial cells is 2.67 kPa in Vitr0.They exhibit morPhological ch柚ge8船weU嬲decreased cell viability following exposure to 5.33 kPa and 8.00 kPa up to 48 hou硌’duration. [Key words] pmssure;comeal endothelial cells;comeal ede眦 【摘要】 目的 观察压力对体外培养的牛角膜内皮细胞形态 结构及细胞活力的影响。方法对体外培养的牛眼角膜内皮 细胞施以2.67 kPa、5.33 kPa及8.00 kPa的压力各6、12、 收稿日期:2008—03—06;修回日期:2008一10一15 作者简介:黄渝侃(1975一),男,湖北武汉人,主治医师。医学博上, 研究方向:角膜病、白内障。 通讯作者:张明昌(E—Inail:Illingchan铲hang@hotmail.com) 著· 24、36、48 h,以不加压组作为对照组。用倒置相差显微镜及 电镜观察细胞形态结构.以台盼蓝染色观察比较48 h时各 组细胞活力的差别,用单因素方差分析比较不同压力下阳性 细胞率。结果 当作用于细胞的压力为2.67 kPa fl kPa= 7.5 mmH曲,作用时间为6、12、24、36、48 h时,与对照组比 较,细胞形态结构均无明显变化;48 h时台盼蓝计数与对照 组比较差异无统计学意义(fkO.776)。当压力为5.33 kPa,作用 时间为24 h时,细胞形态结构出现轻度的损伤,在36、48 h 时加重;48 h时台盼蓝计数与对照组比较.差异有统计学意 义(&0.00)。当压力为8.00 kPa时.6 h时即出现明显细胞形 态结构损害,随着压力和作用时间的进一步增加.细胞的损 伤程度也进一步加重:48 h时台盼蓝计数与对照组比较差异 有统计学意义(&0.000)。结论牛角膜内皮细胞在加压48 h 时只能承受2.67 kPa的压力.当压力为5.33 kPa及8.00 kPa,施压48 h时,将造成细胞损伤及细胞活力下降。, f关键词1压力;角膜内皮细胞;角膜水肿 [中图分类号]R772.2 [文献标识码】A [文章编号】1008一180l(2008)06一046l—04 角膜内皮细胞是位于角膜最内层的单层细胞。 其完整性以及一定的细胞密度对于保持角膜脱水状 态,并维持正常角膜厚度与透明性至关重要。当急性 闭角型青光眼急性大发作,或其他原因导致眼压骤 然升高时。角膜常失去脱水状态。从而导致角膜水 肿、混浊。目前虽已证实高眼压所导致的角膜水肿 是角膜内皮细胞受损引起.但压力对角膜内皮细胞 本身的影响尚未完全明了。本研究通过构建压力模 型,研究不同程度压力对牛角膜内皮细胞(bovine comeal endotllelial cells.bCEC)的影响。 1材料和方法 1.1 材料及试剂 胰蛋白酶(美国,Si舯a公司), EDTA(武汉,凌飞科技有限公司),胎牛血清、DMEM (美困,Gibco公司),青霉素、链霉素、台盼蓝(上海, 碧云天生物技术有限公司)。 1.2牛角膜内皮细胞培养 新生小牛来自武汉市 吴家山奶牛场.于宰杀后立即将牛眼取出,用无菌的 1:5000 H90H溶液及生理盐水冲洗后,于2 h内用 冰瓶运回进行组织培养。角膜内皮细胞的培养采用 一46l一 万方数据 第10卷 眼视光学杂志 第6期 Li等…的方法。无菌状态下将角膜内皮向上放在一 个浅的半球状固定容器内,用无钙的PBS液清洗。 在角膜内皮上加入1 111l含0.25%胰蛋白酶和 O.02%EDTA的消化液.在培养箱内放置5~10 min。然后用塑料小杆轻轻刮擦角膜内皮,将分散的 细胞用吸管转入含有10%胎牛血清和100 U/ml的 青霉素和100 ng,rIll链霉素的DMEM的25 cm2的 培养瓶中,在5%CO:、37℃、95%湿度的培养箱中培 养.每隔2~3 d换培养基。在5~7 d细胞融合后进 行传代,将传至第3代的细胞用于实验研究。 1.3细胞加压模型的建立及分组第3代牛眼角 膜内皮细胞铺满瓶底及瓶内预置的盖玻片后.按张 文强等【2】的细胞加压方法建立细胞加压模型.设加 压压力分别为2.67 kPa、5.33 kPa及8.00 kPa f1 kPa=7.5 mmHg)各组为实验组,未加压组为对照 组,于37℃恒温培养箱中培养,每组细胞重复6瓶。 分别于细胞加压6、12、24、36、48 h时取出部分盖玻 片并收集细胞,做光镜和透射电镜观察。 1.4 细胞形态和结构观察 取出各组瓶内预置的 盖玻片,切片予常规脱蜡,水化,封闭,用PBS冲洗3 次,瑞氏一吉姆萨染液染色30~60 s.PBS冲洗2~3 次,苏木素复染,干燥后用中性树胶封片。用倒置相 差显微镜观察细胞形态。另一部分行电镜切片.用 PBS液冲洗2遍,在2.5%戊二醛液中同定30 min. 以1%四氧化锇固定30 min,梯度酒精脱水。以E. pon812环氧树脂做单层细胞包埋,用钻石刀做超薄 切片,染色后经Hi—tachi Hu一11A透射电镜观察。 1.5 细胞活力观察 将各组细胞于48 h时用 0.25%胰蛋白酶消化,收集后做台盼蓝染色。在血细 胞计数板下。计算染成监色的死细胞及未染色的活 细胞。计算细胞死亡百分率,取平均值。 1.6统计学方法采用SPSS 11.5软件包,对数据 图l对照组正常传至第3代的bCEC Fig.1 The thjrd passage cultulled bovine comeal endothelial (:ells(×200) 采用单因素方差分析。 2 结果 2.1 压力对bCEC细胞形态的影响 对照组牛角 膜内皮细胞呈不规则形状。有多边形、梭形、类圆形 等,均有一大而清晰的核.细胞基本融合,密度较大 (见图1)。2.67 kPa组细胞在48 h内未发生形态变 化,与对照组无明显差异。5.33 kPa组细胞在6、12 h时均未见明显改变.24 h时细胞立体感降低,36 h 时胞浆内出现少量空泡。48 h时宅泡增多。少数细 胞皱缩,核浓缩。8.oo kPa组细胞在6 h时胞浆即出 现空泡,12 h时空泡明显增多,细胞形态改变,呈扁 平状,部分细胞内m现皱缩,核膜、核r欠清楚,核膜 破裂,核内染色质浓缩,细胞密度降低(见图2),48 h 时大量细胞变圆、脱壁浮起。 2.2 压力对bCEC细胞超微结构的影响 对照组 bCEC细胞膜边界清楚。形态规则,线粒体及粗面内 质网丰富,细胞核膜完整,常染色质丰富(见图3)。 2.67 kPa组细胞超微结构未见明显改变。5.33 kPa 组24 h内未见明显改变。48 h时部分线粒体肿胀. 嵴肿胀,排列紊乱,基质疏松.粗面内质网扩张明显。 并见大小不等的空泡f见图4)。8.oo kPa组较前两组 压力继续增高,细胞质内线粒体肿胀,嵴消欠,空泡 样变,粗面内质网呈空泡样扩张.细胞核内染色质粗 细不均,出现核膜不连续、核固缩等损伤(见图5)。 2.3 压力对bCEC细胞活力的影响 根据台盼蓝 染色计算各组细胞死亡率(见表1)。经单因素方差 分析,各组间数值差异有统计学意义(肚415.48,P_ 0.000)。2.67 kPa组与对照组比较.差异无统汁学意 义(P=0.776),5.33 kPa组及8.00 kPa组与对照组 比较差异均有统计学意义(舟0.000)。三个压力组间 比较,差异均有统计学意义(降0.000)。 一462一 图2加压后倒置显微镜下bcEC形态(8.oo kPa组12 h时) Fig.2 Cells appearance under presgure by inverted phase con- trast microscope(×2(x骖(8.00 kPa group at 12 h) 万方数据 第lO卷 黄渝侃,等:压力对体外培养的牛角膜内皮细胞的影响 第6期 图3正常牛角膜内皮细胞超微结构 图4加压后bCEC超微结构轻微改变(5.33 kPa绢48 h时)。白色箭头所指为部分线粒体肿胀,排 列紊乱 图5,氍力增加时bCEC超微结构损伤严重(8.oo kPa组12 h时)。白色箭头所指为核损伤 Fi93 Ultr晒t nlctum 0f bovine comeal endothelial cells(×5000) Fig.4 Ultrastructure of bovine comeaJ endothelial cells changed sli冀htlv un— der pressure(×5()()【)) (5.33 kPa group at 48 h).The wh“e arrow points at the impaired chond—osomes。they we陀f州ollen and黝n群d in a chaotic state. ¨g.5 UltrastnIctul.e of bovine comeal endothelial ce儿s chan卵d ohviouslv when the pressure increased(×5000) (8.OO kPa group at 12 h).’11le white arTows point at the dama只e of nucleu8 表l 不同压力下台盼蓝染色阳性细胞率(n=6,让s) Tab.1 Positive rates 0f Tryp舳blue staining under dif结rent pre8一 sure(n=6,牙±s) pressure(kPa) positive rates of 1bpan blue stai njng(%) O.oo(contr01) 2.67 5.33 8.00 4.Ol±O.29 4.52±O.56 26.9l±3.23+ 57.64±5.11} Comparcd wiIh conl rol gr0“p:+尸O.05 3讨论 角膜内皮细胞受到损伤后通过两种方式代偿功 能:一是周边细胞的扩大和移行.二是细胞分裂增 殖。目前对于人的角膜内皮细胞(human comeal endothelial cells.hCEC)有无增殖能力尚无定论,虽 然在体外表现出潜在增殖能力,但在成人眼中尚未 发现hCEC增殖【3l。年龄、内眼手术、外伤、眼内炎症、 角膜内皮细胞的自发性变性和坏死等凶素均町引起 角膜内皮细胞数量减少,如低于生理临界值则将导 致角膜水肿和混浊,因此。对于角膜内皮细胞的保护 至关重要。 迅速增高的眼压能导致角膜内皮细胞损害,使 细胞密度急剧降低。孙蔚等川发现急性闭角型青光 眼急性发作致角膜内皮细胞降低7.3%~33%,而慢性 闭角型青光眼患眼仅下降1.7%,说明角膜内皮对逐 渐升高的眼压有一定耐受能力,而迅速增高的眼压 可使角膜内皮受损。 既往认为。高眼压造成角膜损伤的主要机制为 以下两方面:其一为高眼压使支配角膜的感觉神经 三叉神经眼支受压迫及角膜缘血管网灌注量下降, 引起角膜营养障碍及角膜低氧。使内皮细胞获得的 能量减少,并引起房水动力学改变.造成细胞结构受 损;其二为角膜内皮泵上的Na+一K+_ATP酶受到高 眼压影响,导致离子主动转运障碍,造成角膜水肿及 内皮细胞损害同。但细胞组织对于压力本身的承受 能力是有限的,如机械压力对于眼内其他组织细胞 如小梁细胞和视网膜细胞等均町以造成机械性损 伤【2一,因此,除了以上岗素外,压力对于角膜内皮细 胞本身直接造成的机械损害也可能是角膜内皮失代 偿的原凶之一。本压力模型在保持其他培养条件相 同的前提下对细胞施加不同程度的压力,所选择的 压力2.67 kPa、5.33 kPa及8.00 kPa分别对应人正 常眼压上限、中度升高的眼压及极度升高的眼压,以 此观察压力本身对于细胞的影响程度。 本研究发现。眼压保持在2.67 kPa的状况时. bCEC形态结构未见明显改变,说明bCEC在一定时 间内对于一定程度的压力具有承受能力。随着压力 的逐渐升高,细胞在形态和超微结构上出现改变。此 种改变表现为在超过细胞承受能力的同等压力状况 下,细胞受压时间越长则细胞形态及超微结构改变 越明湿,在同等受压时间下细胞所受压力越高则细 胞形态及超微结构改变越大。这说明在超过细胞所 能承受的压力范围的状况下。过高的压力和过长的 受压时间均会对细胞造成损害。从台盼蓝染色计数 及统计分析结果可以看出,压力为2.67 kPa时。细 胞活性与对照组比较变化不大,说明在可以耐受的 压力状况下,压力对细胞活性影响不大。而当压力提 高到5.33 kPa时,细胞着色明显增多,与对照组比 较有显著差异,说明超m细胞承受能力的压力会导 —463— 万方数据 第10卷 眼视光学杂志 第6期 致细胞活力下降,不仅对细胞形态及超微结构造成 影响,而且会导致死亡细胞明碌增多。随着压力进一 步增高,细胞活力进一步下降,大量细胞死亡,而残 存的细胞在形态上和超微结构上也同时反映出严重 的不健康状况。因此可以认为,压力本身可以对 bCEC造成严重影响的.此种影响和以上提到的两 种主要影响机制同时存在。故对于高眼压患者的眼 压进行及时有效的控制是非常重要的。它不仅是为 了保护视神经组织,同样也保护了眼内其他重要组 织。其中也包括角膜内皮细胞。 本研究发现。压力越高,作用于角膜内皮细胞时 间越长,则细胞形态结构损害越严重。而细胞结构的 损害与既往发现的角膜内皮细胞神经营养机制异常 和角膜内皮泵上的Na+一K+_ATP酶破坏之间有何关 联尚待进一步研究。对压力下损害的细胞结构和功 能的研究也有望进一步揭示高H艮压下角膜内皮细胞 损害的发生机制。 参考文献: 【l】 “J,Sun XC,Bon柚no JA.Role of NBCl in印ical arId ba- 舯lateraJ HC03一 pe咖eabilities 蚰d tmn跎ndothelial HC03一 nuxes in bovine comeal endothdium团.Am J Physio王 CeU Physiol,2005,288(3):739—746. 【2】张文强,杨新光,郭斌。等.压力对体外培养牛眼小梁细胞的影 响『J1.第四军医大学学报,2003,24(9):802—804. f31 Joyce NC,Zhu CC.Human comeaI endothelial cell pmlifem- tion:potential for use in regenerative medicine U】. Comea, 2004,23(8 Suppl):s8一S19. 【4】孙蔚,蔡鸿英,孟宪锐,等.急性服压升高与角膜内皮细胞关系 的探讨[J1.中国实用眼科杂志。1999。17(8):503—505. 【5】王继红,码力.青光眼患者持续高眼压及眼压恢复正常后角膜 内皮细胞损伤及修复的研究现状【J】.包头医学院学报,2002,18 (4):376—379. 16J李树宁,工睁o};,f大博,等.压力对体外培养大鼠视网膜 MnIler细胞的影响U】.巾华眼科杂志,2(J()5,4l(4):325—329. (编辑:柴玲玲,徐晓泉) (上接第460页) 讨论:脉络膜缺损属先天性眼底异常.足南于脉络膜发 育过程中眼泡胚裂发育不全,胍裂后端闭合过程受到干扰, 后端闭合lfl断或延迟.脉络膜发育停止于某一阶段所致。该 病多双眼发病,但也可为单侧.多伴有其他先天性发育小良。 如小眼球、虹膜缺损、黄斑发育不良等:亦町伴发伞身他处先 天异常,如胆囊缺如等lI_2l。本文报道的2例患者,在主觉症状 上有明显的差异:第l例患者无明显自觉症状。因配戴硬性 角膜接触镜不能提高视力.前来医院检查眼底时被发现:而 第2例患者,则㈥夜盲症状前来就诊.在行常规眼科检杏时 被发现。在形态上,2例患者均表现为典型的卵圆形缺损灶. 且均位于视乳头下方胚裂处。第l例患者虽然病灶范围较 大。但比较局限,且未伴发其他疾病,故无自觉症状;Inf第2 例患者除了有脉络膜缺损灶,同时伴有黄斑区牛眼样发育不 良和视网膜色素变性,故其前来就诊时所诉症状为夜|'日J视力 下降。 在临床检查此类患者时应注意与脉络膜相关肿瘤如脉 络膜血管瘤相鉴别。脉络膜m管瘤发病缓慢,病情呈进展性, 一般无色素、透光,边缘不确定。黄斑部如继发改变会出现视 网膜下的硬性渗出、视网膜色素上皮改变和视网膜前膜形成 等。在FFA表现为动脉前期高荧光.晚期口『见大最荧光渗漏 并着染。而先天性脉络膜缺损的典型形态通常为直立的三角 形,也可为盾形或横椭圆形,小者仅为l~2 PD,大者可超过 一个象限。f}I于缺乏脉络膜层.对应的视网膜也多发育不良, 组钐{菲薄旱大嗍眼状,厚薄不匀。部分缺损Ⅸ缺乏脉络膜毛 细If『l管,有时则ur见残存的脉络膜大血管.缺损区表面的视 网膜血管,行径大致正常或有巾断现象,办有滑缺损边缘绕 行的。缺损区与视乳头之间的Ⅸ域多无特异性表现。本文报 道的2例患者,在FFA帛.期均无高荧光表现,缺损灶内可见 少许脉络膜lfIL管。第1例患者,血管晕屈膝状。从缺损灶巾屈 膝状爬出.造影晚期可见少许荧光渗漏并着染。而第2例患 者晚期未见荧光渗漏,始终表现为低荧光灶。 此外.最常她的非典型性先天性脉络膜缺损多发生在黄 斑部,也可发生在眼底的上方、鼻侧及颞侧。在日常诊疗过程 中.还庇注意与其他原凶如葡萄膜炎所致的陈旧性脉络膜病 灶相鉴别,后者形状不一,边缘不整齐,往往不足单一的,可 有多发病灶。萎缩区则有瘢痕组织和大量色素游离。 脉络膜先人缺损合并黄斑发育不良患者,视力一般较 差。脉络膜先天缺损较易合并发生视网膜脱离,因此.目前提 倡存视网膜未脱离或脱离尚低平时,可用激光沿缺损区外有 色素的视网膜上光凝,形成堤坝式色素性激光瘢痕。 参考文献: 【11何守志主编.临床眼科学fMl.天津:科学技术}fj版社.2002: 564. 【2】张承芬主编.眼底病学【M】.北京:人民卫生Hj版社,1998:168— 171. (编辑:柴玲玲) 一464— 万方数据
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