干扰素-β对胶质瘤的生长抑制以及对其他细胞因子的调节作用的初步研究.pdf

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干扰素-β对胶质瘤的生长抑制以及对其他细胞因子的调节作用的初步 研究干扰素-β 对胶质瘤 的生长抑制 对其他细胞因子的调节作用 干扰素-β对 胶质瘤 的生长抑制及对其他细胞因子 研究干扰素β 的生长抑制和
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第16卷第13期 2006年7月 中国现代医学杂志 China Journal of Modem。Medicine V01.16 No.13 Jul.2006 文章编号:1005—8982(2006)13—1944—04 干扰素一p对胶质瘤的生长抑制以及对其他 细胞因子的调节作用的初步研究 李光宇1,郭宗泽,,刘 薇,,赵彦艳: (1.中国医科大学附属第一医院神经外科,辽宁沈阳110001; 2.中国医科大学基础医学院医学遗传学教研室,辽宁沈阳110001) ·论著· 摘要:目的研究干扰素一13(IFN—B)对胶质瘤细胞系SK—MG一1的生长抑制作用和诱导凋亡的作用。 并研究IFN—p在sK—MG一1细胞系中对其他细胞因子的调节作用。方法分别用IFN—B基因和蛋白刺激 胶质瘤细胞系sK—MG一1,通过MTT方法检测细胞增殖情况,并运用流式细胞技术检测其对凋亡的影响,同 时用实时定量PCR的方法检测细胞因子的变化。结果 结果显示IFN—B可以抑制细胞增殖,诱发细胞凋亡, 定量PCR结果显示在胶质瘤细胞细中IFN—p上调白细胞介素一1 p(IL一1 p)和肿瘤坏死因子一0【 (TNF一Ⅸ)的mR_NA表达,同时一过性下调白细胞介素一6(IL-6)的mRNA表达。结论IFN—B可以抑制 胶质瘤细胞系sK—MG一1的增殖,诱发细胞的凋亡。可以调节其他细胞因子的表达。 关键词:胶质瘤;IFN—B;实时PCR 中图分类号:R730.263 文献标识码:A Primary study of growth inhibition and cytokine regulation effect of interferon-13(IFN—B)on glioma cell line SK—MG一1 LI Guang—yul,GU0 Zong-zhel,HU Weil,ZHAO Yan-yan2 (1.Department of Neurosurgery,the First Affliated Hospital of China Medical University,Shenyang, Liaoning 110001,P.R.China;2.Department of Genetics,China Medical University, Shenyang,Liaoning 110001,P.R.China) Abstract:【Objective】To study the growth regulation effect and cytokine regulation effect of interferon一130FN— B)on glioma cell line for the purpose of further studies on IFN-13 gene therapy on glioma.【Methods】We stimulat— ed the SK-MG一1 cells with IFN-13 protein and IFN-13 gene transfection with liposome.After that we used MTr method and flow c”ometry to investigate the growth inhibition effect and apoptosis induction effect of IFN—B on SK— MG一1 cells.Than real—time PCR method was used to detect the cytokine network induced by IFN—B. 【Results】 IFN—B protein and gene could suppress the growth of SK—MG一1 cells and induce apoptosis.We also found that in— terleukin一6 0L一6)expression reduce transiently after IFN-13 stimulation but intedeukin-1 13(IL-13)and tumor necro— sis factor一0l(TNF—d)expression were up regulated.【Conclusion】IFN—p can suppress sK—MG一1 cell growth and induce apoptosis.It can also activate cytokine network in this cell line. Key words:glioma;IFN——13;real——time PCR 胶质瘤是最常见的颅内肿瘤,虽然经过数十年 的研究和探索,即使在脑手术技术和放、化疗法十分 发达的今天,胶质瘤尤其是胶质母细胞瘤的预后仍 然没有明显的提高。人们正在寻找更有效的方法, 收稿日期:2005-09—27 【通讯作者】赵彦艳 免疫疗法和免疫基因治疗是其中之一。在脑胶质瘤 的治疗中干扰素一B(interferon—p,IFN—B)正日 益受到关注,现在已经广泛应用于临床中。本研究 试图研究IFN—B对胶质瘤细胞系SK—MG一1的生 ·1944· 万方数据万方数据 第13期 李光宇,等:干扰素一B对胶质瘤的生长抑制以及对其他细胞因子的调节作用的初步研究 长抑制作用和凋亡诱导作用,并研究其对其他细胞 因子的调节作用,以便更好的利用IFN—B治疗胶 质瘤。 1材料和方法 1.1细胞系和试剂 人类胶质瘤的细胞系SK—MG一1维持在MEM 培养基中,并加进10%小牛血清和抗生素。人类重组 IFN—B蛋白(Takara-一Shuzo,Japan馈赠)。质粒 psv2IFN一6(名古屋大学医学部神经外科馈赠)。 TRIzol RNA提取试剂盒(Invitrogen公司)及Dnasel Takara公司)。R N A扩增试剂盒(Roche公司)。 1-2阳离子脂质体的制备 正电荷的脂质N一仅trimethyl alTlmo— nioacetyl—didodecyl—D glutamate chloride(TMAC), diauroyl phosphatidylcholine(DLPC)和dioleoyl phos.一 phatidyl ethanoamine(DOPE)用来制备载体。上述3 种物质按1:2:2的摩尔比(共1斗m01)溶于 500斗L的氯仿中,经真空蒸发后形成的膜以含 20IXg psv2IFN—B的200IXL的PBS溶液溶解,然 后震荡2min,以PBS校正到500仙L。 1.3 MTT比色法测定细胞增殖曲线 用2.5 g/L胰酶消化单层培养的细胞,用培养液 制成单细胞悬液,以每孔2×lff‘个细胞接种于24 孔板,每孔加人1 mL培养基,于37℃,5%CO。环境 中培养。次日换液,分成四组,一组为对照组,一组 为空载体对照组,一组为IFN—B蛋白组,加2 000 IU/mL的重组蛋白,一组为IFN—B基因组。加入上 述制备的脂质体含(O_3 ng/mLpSV2一IFN—B)隔日 测量1次,每次6个复孔,连续6 do测量方法为每孔 加M,rr溶液(5 dE)75¨L,37℃孵育4 h,弃上清, 加DMS0500斗L,振荡15 min。选择490nm波长,在 酶联免疫检测仪上测定个孑L的吸光度,并绘制A值 一时间曲线。肿瘤细胞的生长抑制率=(1一实验组 平均吸光度,对照组平均吸光度)x 100%。 1.4流式细胞检测凋亡 取对数生长期的SK—MG一1细胞传代后24 h分 成四组,一组为对照组,一组为空载体对照组,一组 为IFN—p蛋白组,一组为IFN—p基因组。在刺激 48 h和72 h后搜集细胞,以PBS冲洗2次,后以 PBS制成1.5 mL的细胞悬液,一.20。C的无水乙醇3 mL,4℃保存12 h固定,去除固定液,PBS洗两次,加 入RNA酶37℃30 min,碘化丙啶染色,4℃避光30 min。上机检测。 1.5细胞准备,RNA提取和Dnasel的处理 SK-一MG一1细胞以1 X 105/mL的密度种植于5 mL的培养瓶中然后在37℃的培养箱中过夜。然后 更换培养液,并加入2 000 IU/mL IFN—B蛋白和 0.3 ug/mL的阳离子质脂体IFN—B。处理过的细胞 继续培养,于12、24和48 h,分别收集细胞并提取 RNA,然后用DnaseI处理以除去DNA的污染。 1.6实时定量PCR:引物设计如下 IFN-B for 5'ATG AGC TAA ACT TGC TI“3'rev 5’GTT TCG GAG GTA ACC TGT 3’TNF一仪for 5’ACA AGC CTG TAG CCC ATG TT 3’rev 5’AAA GTA GAC CTG CCA GAC T 3’Ikl B for 5’GGA TAT GGA GCA ACA AGT GG 3’rev 5’ATG TAC CAG TTG GGG AAC TG 3’IL一6 for 5’AAC TCC TTCT CCA CAA GCG 3’rev 5'TGG ACT GCA GGA ACT CCT T 3’B-actin for 5’CACT CTT CCA GCC TTC CTT CC 3’rev 5’CGGA CTC GTC ACT A,CT CCT GCT T 3。。应用Light,一.cycler Real.一.time PCR仪(Roche)和SYBER.一GREEN RNA 扩增试剂盒IIRoche)。一步法RT—PCR反应体系为 20 Ix L,具体方案依据试剂盒的条件。反应条件为逆 转录55℃10 min,然后95cC 40 s变性,循环条件 为95℃0 s,57℃10 S,720C 18 s,循环数为45。此 后进行溶解曲线的分析,条件为950C 0 S,65℃10 S,95℃0 S,然后是40。C 30 S的冷却。在每次分析 时都用pSV2一IFN—B质粒做标准曲线,以B—actin 做内对照。 1.7统计学分析 应用SPSSIO,.1统计软件,对结果进行t检验。 2结果 2.1 IFN—B基因和蛋白刺激可以抑制胶质瘤细胞 系SK—MG一1的增殖 MTr的结果显示,IFN—p蛋白和IFN—p基因 转染可以明显的抑制SK.一MG-一1细胞的生长。蛋白 组48 h的抑制率为22.1%,而IFN—B基因转染组 48 h的平均抑制率为37.3%;而72 h蛋白组的抑制 率为25.7%,基因组为46.0%。与对照组和空质粒组 差异存在显著性(P0.01)。结果表明IFN.一B蛋白和 基因刺激可以抑制SK-一MG一1细胞的增殖,而 IFN—B基因的抑制作用强于IFN—B蛋白的作用, 见表1。 ·19钙· 万方数据万方数据 中国现代医学杂志 第16卷 表1 IFN一13蛋白和基因对SK—MG一1细胞的生长抑制作 表2 IFN一13对SK—MG一1细胞其他细胞因子表达的影响 用————————i■————i■———■汀■———_:i_ 2.2 IFN—B基因转染和蛋白对SK-MG一1细胞凋 亡的影响 流式细胞的结果表明IFN一13基因和蛋白可以 明显诱导SK—MG一1细胞的凋亡。蛋白组48 h的凋 亡率为16.95%,而IFN一13基因转染组48 h的平均 凋亡率为31.90%;而72 h蛋白组的凋亡率为 21.78%,基因组为48.21%。与对照组和空质粒组差 异存在显著性(Po.01)。结果表明IFN一13蛋白和基 因刺激可以诱导SK—MG一1细胞的凋亡,而IFN—B 基因的抑制作用强于IFN—B蛋白的作用,见附图。 附图IFN-B蛋白和基因对SK-MG-1细胞的凋亡的影响 2.3 IFN—p基因转染和蛋白对SK—MG一1细胞其 他细胞因子的表达的影响 本实验检测了在IFN—B蛋白和基因刺激后, 胶质瘤细胞系SK—MG一1中其他细胞因子包括 TNF—Ot、IL一1 B和IL一6的表达变化。IFN—B蛋白 和基因可以诱导胶质瘤细胞系中其他的细胞因子如 IL一1 B、IL一6和TNF一仪的表达变化。发现在胶质瘤 细胞系中IFN—B基因比蛋白能更强烈的诱导细胞 因子的变化,当IFN—B蛋白作用于细胞系中时, IL_6先是下调,然后在24 h后恢复到原始水平,而 IL一1 B和TNF—Ot在IFN 13刺激后上调。IFN—B 基因刺激细胞后,IL一6基因的表达在12 h下调,而 在24 h恢复原始水平,但是在48 h升高。而对 IL一1 B和TNF一仪的调节作用则强于蛋白的刺激。 见表2、3。 表3阳离子脂质体转染IFN—B基因对SK—MG一1细胞其 他细胞因子的影响 3讨论 胶质瘤是人类最常见的恶性肿瘤,现有的各种 治疗方法都不能取得较好的疗效。目前人们将目光 投向基因治疗,尤其是免疫基因治疗。现用于基因 治疗的载体有多种,各有其特点,对载体的要求是易 于制备,可灭菌,转染效率高,没有副作用。阳离子 多层脂质体(Cationic multilamellar liposomes)符合 上述要求,并可以重复使用,无论是在实验室还是在 临床都有广阔的应用前景。 IFN—B是1型干扰素的一种,是一种经典的细 胞因子。最初发现它具有抗病毒活性【1】,之后人们发 现它具有多种生物活性包括抗肿瘤活性。IFN—B通 过抑制转化,促进凋亡,激活免疫系统多种途径抑制 肿瘤细胞的生长和杀伤肿瘤细胞【2.3]。对IFN—B信 号传导的研究很多,认为它是通过和受体结合激活 受体相关的酪氨酸激酶的磷酸化,从而激活(signal transductors and activators of transcription,STAT)。 而STATl、STAT2和另一些蛋白形成复合转录因子, 结合于受调控基因的(interferon—stimulated response element,IRSE)上调控这些基因的转录。这些基因包 括FAS,CASPASE8;10等,而这些是导致细胞凋亡 和死亡的因子14,5]。本研究表明IFN—B可以抑制 SK—MG一1细胞系的生长并诱导细胞的凋亡,同时发 现IFN—p基因转染对细胞的生长抑制作用和凋亡 诱导作用均强于蛋白刺激组,提示利用IFN—B基 因治疗的方法可能更有效果。 干扰素可通过转录水平调节其他细胞因子的表 达来发挥它的多种效应[63,这些细胞因子包括IL.1、 IL一2、IL一6、IL一8、IL_1受体和肿瘤坏死因子。但是细 ·1946· 万方数据万方数据 第13期 李光宇,等:干扰素一B对胶质瘤的生长抑制以及对其他细胞因子的调节作用的初步研究 胞因子之间的相互作用十分复杂,根据不同的细胞 和不同的条件细胞因子之间的相互作用也各不相 同。在许多肿瘤和其他疾病的发生和治疗中,细胞 因子的网络发挥重要的作用n81。这与人胶质瘤细胞 的发生发展和许多的细胞因子有密切的关系,其中 IL一1 B、IL一6和TNF—Ot受到关注,但是这些细胞因 子的作用还不是十分的确切。IL一1主要在巨噬细胞 产生,被认为主要参与炎症反应,同时在细胞因子的 网络中起到重要的作用。有人报道IL一1 B在胶质瘤 中可以刺激IL一6和TNF—Ot的产生,但是还存在不 同的观点网。在笔者的实验中IFN—B基因和蛋白都 可以刺激IL一1 B的表达上调,但是IFN—p基因能 更有效的上调IL_l B的表达。 IL一6是一种多功能的细胞因子,在体内起到重 要的生物学功能,和一些肿瘤的发生和发展关系密 切,并对一些肿瘤的治疗有潜在的价值。实验表明 很多的胶质瘤细胞可自发地分泌IL一6,并且IL一6 的表达量和肿瘤的发生和恶性程度相关[101。IL_6被 认为和肿瘤的进展以及对凋亡的抵抗有关,还有实 验证明IL一6高表达的肿瘤细胞对放射治疗具有抵 抗能力。因此,有人认为IL-6的过表达是胶质瘤恶 性程度的标志之一【11]。在本研究中IL一6的表达在 IFN—B刺激后24 h内有短暂的下调,但是在48h 后恢复到原来的水平,提示IFN—B对胶质瘤的生 长抑制和诱导凋亡的作用可能是通过对IL一6的抑 制来实现的。 TNF—d也是一个多功能的细胞调节因子,具 有抑制细胞增殖,细胞毒性,调节基因的转录等功 能【12]。是现今为止发现的直接杀伤肿瘤细胞作用最 强的细胞因子,但是直接应用的毒性很强,限制了在 临床的应用。在白血病中IFN对TNF一仅的调节被 认为与IFN的治疗效果有关系,但是在胶质瘤中还 不能证明这种关系。本研究证实IFN—B可以在人 胶质瘤细胞系中诱导TNF—Ot的表达上调,而在 IFN—B基因刺激的情况下这种上调比IFN—B蛋白 刺激的上调更明显。提示IFN—B对胶质瘤的治疗 作用可能和TNF—OL的表达上调有关。 结果表明IFN—B基因和蛋白刺激人胶质瘤细 胞系可引起其他细胞因子的表达变化,而这些变化 可能和IFN—B的抗肿瘤作用有关。具体的机制有 待进一步的研究。 参考文献: 【1】SEN GC,RANSOHHOFF RM.Interferon—induced antiviral tiC-- tions and their regulation[31.Adv Virus Res,1993,42:57-102. 【2】NATSUME A,TSUJIIMUR K,MIZUNO M,et a1.IFN-beta gene therapy induces systemic antitumor immunity against malignant glioma[J].J Nettrooncol,2000,47(2):1 17-124. 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