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    CN1814747-一种微生物发酵生产丁二酸的菌种和方法-公开.docx

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    CN1814747-一种微生物发酵生产丁二酸的菌种和方法-公开.docx

    一种微生物发酵生产丁二酸的菌种和方法申请号 CN200610038113.6 申请日 20060124申请(专利权)人 [江南大学]地址 江苏省无锡市惠河路 170 号发明人 [孙志浩, 郑璞, 刘宇鹏, 朱蕾蕾]主分类号 C12N1/202006.01公开(公告)号 CN1814747公开(公告)日 20060809代理机构 无锡市大为专利商标事务所代理人 [时旭丹]www.patexplorer.com1(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利(10)授权公告号 CN1814747(45)授权公告日 20060809(21)申请号 CN200610038113.6(22)申请日 20060124(71)申请人 [江南大学]地址 江苏省无锡市惠河路 170 号(72)发明人 [孙志浩, 郑璞, 刘宇鹏, 朱蕾蕾](74)专利代理机构 无锡市大为专利商标事务所代理人 [时旭丹](54)发明名称一种微生物发酵生产丁二酸的菌种和方法(57)摘要一种微生物发酵生产丁二酸的菌种和方法,属于生物工程技术领域。具体涉及一种发酵糖质原料产生丁二酸的微生物琥珀酸放线杆菌ActinobacillussuccinogenesSW0580,保藏号 CGMCC No.1593,以及利用该微生物发酵生产丁二酸的方法。该微生物是从瘤胃中分离并鉴定的琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes,在通CO2 和 N2 的厌氧条件并维持 pH5.5-7.0 的环境下,厌氧发酵 20-100g/L 的糖质原料可生产 10-50g/L 丁二酸。2权 利 要 求 书1.一种发酵生产丁二酸的微生物菌株,其分类属巴斯德菌科 pasteurellaceae放线杆菌属Actinobacillus的琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenesSW0580,保藏号为 CGMCC No.1593。2.一种微生物发酵生产丁二酸的方法,其特征是发酵菌株为 CGMCC No.1593;发酵培养基组成为糖质原料 20-100g/L,氮源 1-50g/L,酵母膏 5-25g/L, Na2HPO412H2O 1.0-5.0g/L,NaH2PO42H2O 1.0-5.0g/L,NaCl 1.0-5.0g/L,MgCl2 0.1-5.0g/L,CaCl2 0.1-5.0g/L,乙酸钠 0.1-5.0g/L,生物素 1-5ml/L,混合维生素 1-10ml/L,培养基 pH3~8;所述混合维生素组成为B12 5mg,B6 100mg,叶酸 20mg,核黄素 20mg, 硫胺素20mg,烟酸 20mg,泛酸 50mg,对氨基苯甲酸 50mg,蒸馏水定容至 1000ml;发酵培养按 1%-10%的接种量将培养好的种子接入发酵培养基,培养温度 30~40℃,发酵在通 CO2 或 N2 的厌氧条件下,厌氧培养 1-4d;发酵过程中,用碳酸盐、氨水或液碱维持发酵液的 pH5.5-7.0。3.根据权利要求 2 所述的方法,其特征是糖质原料包括葡糖糖,果糖,麦芽 糖,木糖,蔗糖,乳糖,半乳糖,乳清,及木薯、玉米、甜菜或木质纤维素的 水解物或糖浆。4.根据权利要求 2 所述的方法,其特征是氮源包括豆饼粉、玉米浆、尿素、 或无机铵盐。3说 明 书一种微生物发酵生产丁二酸的菌种和方法技术领域一种微生物发酵生产丁二酸的菌种和方法,属于生物工程技术领域。具体 涉及用一种厌氧微生物发酵生物质原料生产丁二酸的菌种和方法。背景技术丁二酸,又称琥珀酸succsinic acid,分子式为 C4H6O4,分子量为 118.09, 是一种常见的天然有机酸,广泛存在于人体、动物、植物和微生物中。丁二酸是工业上一种重要的四碳化合物,它作为有机合成原材料、中间产 物或专业化学制品广泛应用于食品、医药、农药、染料、香料、油漆、塑料和 材料工业。它最大的市场是表面活性剂、清洁剂、绿色溶剂、离子鳌合剂、生 物可降解塑料等领域。在食品行业中作为酸化剂、pH 改良剂、风味物质和抗菌 剂,以及作为原料或中间体用于医药、抗生素、氨基酸和维生素的生产Appl Microbiol Biotechnol,1999,51545-552。此外,丁二酸盐还可以用做反刍动 物和单胃动物如猪的饲料添加剂以及植物的助长剂。目前,丁二酸和它的大多 数衍生物的生产还处在进一步研究和开发阶段。目前已开发出多项技术将丁二酸转化为重要的工业化学品,包括 N-甲基吡 咯烷酮、1,4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯PBT 树 脂、己二酸等。其中许多化工产品都是以苯为原料合成的,苯是石油或煤化工 产品,资源紧缺,不可再生。目前已大约有 250 种以苯为原料的化工产品可以 通过丁二酸为原料来生产。因此,全球对丁二酸的需求不断增加。工业上丁二酸的生产方法主要为化学方法,主要有石蜡氧化法、轻油氧化 法、丁烷氧化法、丁二腈水解法、催化加氢法以及以乙烯和一氧化碳为原料的 电解氧化法。目前,国内外主要使用的是催化加氢法。以化学方法获得丁二酸,不可避免地要消耗大量不可再生的石化原料,还 对环境造成严重污染,存在转化率低,易污染环境等弊端。丁二酸的生产可通过化学合成方法或者发酵方法来进行,由于石化原料的 日趋减少,用微生物发酵碳水化合物生产丁二酸的方法日益受到人们的重视。 由于发酵法生产丁二酸是以可再生糖源如葡萄糖和二氧化碳作为主要原料,因 此微生物发酵法生产丁二酸,具有成本低和摆脱对石化原料依赖的优点,而且 开辟了温室气体二氧化碳利用的新途径,更加显示了环境友好特征。丁二酸是继柠檬酸后最具市场潜力的发酵有机酸产品,但目前大都还是用 化学方法生产。1999 年全球丁二酸的需求量为 27 万吨,2001 年为 48 万吨,2002 年地市场需求量为 59 万吨。以大约 10 万吨/年的幅度递增。根据美国 Michigan 大 学 MBI 研究所的估计,在未来几年内,丁二酸的年需求将达到 100 万吨的水平。丁二酸是许多严格厌氧菌和兼性厌氧菌代谢的重要中间产物。产丁二酸的 微生物有丙酸产生菌,例如 Propionibacterium sp.;典型的肠杆菌,例如 E.coli、 Pectinatus sp.;瘤胃菌,例如Actinobacillus succinogenes、Bacteroides amylophilus、 Brebibacterium divaricatum、Succinimonas amylolytica、Succinivibrio dextrinisolvens、Wolinella succinogenes、Ruminococcus flavefaciens 等。此外,一些乳酸菌的菌株也可产生少量的丁二酸。其中产丙酸菌可积累低浓度的丁二酸,从瘤胃中分离出来的瘤胃菌如琥珀 酸丝状菌 Fibrobacter SuccinogenesWeimer,1993、琥珀酸弧菌 Succinivibrio dextrinisolvensO’Herrin and Kenealy,1993、Bacteroides ruminicolaHowlett, 1976、Bacteroides amylophilusCaldwell,1969等也可产丁二酸,且产量比 丙酸菌高。但瘤胃菌发酵有许多低产量的副产物,发酵不稳定,多数菌株在生 产上不能满足工业4生产在经济上的要求。虽然有报道琥珀酸放线杆菌 Actinobacillus succinogenesATCC55618US 5,504,004,1996;US 5,723,322,1998 产丁二酸含量 70g/L,产率 80%以上、厌氧螺菌 Anaerobiospirillum succiniciproducens ATCC 29305US 5,143,833,US 5,143,834 和 US 5,168,055, 1992产丁二酸 43g/L,产率 91%。基因工程菌 E.coli AFP111/pTrc99A-pyc 产 丁二酸 99.2g/L,产率 110%Vemuri,J.Industrial Microbiology Biotechnology, 2002。但在国内,这些菌株不容易获得,并且培养发酵条件要求高,不宜用于 国内的工业生产。因此,在国内自主创新地筛选能耐受高浓度丁二酸的微生物 菌株,并且研究出一种能够生产高浓度丁二酸的发酵方法是很有必要的。发明内容本发明的目的是提供一种微生物发酵生产丁二酸的菌种和方法,该菌株是 一株能有效生产丁二酸的新菌株,用该菌株发酵廉价的糖质原料生产丁二酸的 方法。以下是本发明技术方案的详细描述。微生物菌株的筛选与鉴定在本发明中,建立了一个快速有效的筛选高产丁二酸菌株的模型。根据产 丁二酸菌株其细胞代谢过程中产生较高的富马酸脱氢酶Van der Werf,Arch Microbiol,1997这一点特性,设计出以富马酸钠为唯一碳源的选择性平板, 筛选出能够利用富马酸的菌株。由于富马酸脱氢酶能够将富马酸转化丁二酸, 而富马酸在酸性条件下呈浑浊状,因此可以挑选透明圈较大的菌落以筛选出富 马酸脱氢酶较高的菌株。本发明从牛、羊等食草反刍类动物的瘤胃中采样,取瘤胃消化物于含富马 酸的富集培养基中厌氧富集培养 2-4 次,再涂布于以富马酸钠为唯一碳源的选择 性分离平板上,在充满 CO2 的环境中培养。挑选透明圈较大的菌落,再用装有 发酵培养基的试管,厌氧发酵初筛,2-3 天后取清液,点样到硅胶层析薄板上, 于苯∶乙酸乙酯∶乙酸体积比为 2∶1∶0.03 系统中展层,用溴酚兰显色。将保 留有丁二酸显色斑点的菌株再转接于装有发酵培养基的三角瓶中进行厌氧发酵 复筛,36-72h,用 HPLC 法Lichrospher C18 2504.6mm,5μm;流动相 50 mmol/L KH2PO4,pH 2.8,紫外检测波长 210nm测定丁二酸的含量。经过对多个 瘤胃样品的大量菌株筛选工作,从分离出来的近数百株瘤胃细菌中共初筛选出 近几十株产丁二酸的菌株,最后复筛得到杂酸较少,遗传稳定性好的产丁二酸 菌株 SW0580 菌株。本发明筛选得到的能有效积累丁二酸的微生物 SW0580,经 16S rRNA 基因 测定和按伯杰氏细菌鉴定手册第八版生理生化鉴定,认为属巴斯德菌 科pasteurellaceae放线杆菌属Actinobacillus的琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes。该菌的细胞成棒状,不运动,无芽孢,在营养肉汤培养基中可 见典型的放线杆菌特征,即散开的类球颗粒组成貌似“密码”的杆菌摩尔斯 电码和链状呈摩尔斯电码形。格兰氏阴性,兼性厌氧。100%CO2 环境下,菌 体单独生长、成群生长和成链生长。在 TSB 琼脂培养基上的菌落成环形、完整、 灰色、半透明,在有CO2 存在时,37℃条件下培养 24h 后,直径可达 1~1.5mm。 在空气中培养时菌体黏着在平板上。菌株在平板、斜面上保存一周后,有明显 的衰亡现象。微生物菌株的种子培养与发酵种子培养基的组成为葡萄糖 5-15g/L,酵母膏 5-10g/L,玉米浆 5-15g/L, Na2HPO412H2O 0.5-2.0g/L,NaH2PO42H2O 0.2-2.0g/L,混合维生素 1-10ml/L, pH 6.0-7.0。发酵培养基糖质原料 20-100g/L,氮源 1-50g/L,酵母膏 5-25g/L,Na2HPO412H2O 1.0-5.0g/L,NaH2PO42H2O 1.0-5.0g/L,NaCl 1.0-5.0g/L,MgCl2 0.1-5.0g/L, CaCl2 0.1-5.0g/L,乙酸钠 0.1-5.0g/L,生物素 1-5ml/L,混合维生素 1-10ml/L,培 养基 pH3~8。5所述混合维生素组成为B12 5mg,B6 100mg,叶酸 20mg,核黄素 20mg, 硫胺素20mg,烟酸 20mg,泛酸 50mg,对氨基苯甲酸 50mg,蒸馏水定容至 1000ml。种子培养基和发酵培养基的灭菌温度为 115-121℃,15min。维生素等热敏 性材料配制后 0.2μ 膜滤除菌,接种前加入。将实验菌株接种到种子培养基中,100ml 三角瓶装液 20~80ml,于 30-40℃ 在充满 CO2 的环境中静止、或在有氧的条件下震荡,培养 24-48h。按 1%-10%的接种量将培养好的种子接入发酵培养基,培养温度 30~40℃, 发酵在通 CO2 或 N2 的厌氧条件下,厌氧培养 1-4d。用于发酵的糖质原料碳源可以是葡糖糖,果糖,麦芽糖,木糖,蔗糖,乳 糖,半乳糖,乳清,及木薯、玉米、甜菜或木质纤维素的水解物或糖浆。豆饼 粉、玉米浆、尿素、或硫酸铵等无机铵盐可作为培养基的氮源,发酵培养基中 还含有磷酸盐、乙酸钠等无机盐和生物素及混合维生素。发酵在通 CO2 或 N2 气 体的厌氧环境下进行,30-40℃静止或搅拌培养,并用碳酸盐、或氨水、或液碱 维持发酵液中的 pH 在 5.5-7.0。本发明的有益效果本发明的特点是从新鲜瘤胃中分离了有效产生丁二酸 的琥珀酸放线杆菌 CGMCC 1593,其在厌氧等适合条件下,能显著地积累丁二 酸,产丁二酸达到 10-50g/L,最高达到 40g/L 以上,可满足实现工业生产在经 济上要求。本发明突出的优点是利用廉价的玉米、木薯等可再生的农副产品为原料发 酵生产丁二酸,是一种可持续的生产方法,可缓解丁二酸化学合成的石化资源 紧张问题,对环境友好。以下是琥珀酸放线杆菌 CGMCC 1593 筛选、鉴定及发酵生产丁二酸的实施 例。但本发明并不限于所列出的几个实例。生物材料样品保藏琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenesSW0580 菌株已于 2006 年 1 月 23 日保存在中国北京中关村中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心,保藏号 CGMCC No1593。具体实施方式实施例 1从无锡市某肉牛屠宰场刚宰杀牛的新鲜瘤胃中采样,取瘤胃中消化物,接 种于装有 80mL 含富马酸钠的富集培养基的三角瓶中,37℃厌氧培养约 36-48h, 按 10%的接种量再进行两次富集。取富集培养物用 PBS0.145mol/L 氯化钠, 0.01mol/L 磷酸钠水溶液稀释并涂布于以富马酸钠为唯一碳源的平板筛选培养 基的选择性平板上,培养48h。挑选透明圈较大的菌落,接种至装有 5mL 发酵 培养基的试管中,厌氧培养 36h。用 TCL 法测定上清液,160 个菌落中共选出 72 株类似丁二酸斑点的菌落。其中富集培养基g/L玉米浆 20,葡萄糖 15,富马酸钠 5.88,CaCl2 0.2, MgCO3 10,K2HPO4 3.0,NaCl 1.0,NH42SO4 1.0,MgCl2 0.2。平板筛选培养基g/L富马酸钠 25,蛋白胨 10,酵母膏 5,NaCl 5,NaHCO3 2,半胱氨酸盐酸盐 1,琼脂 20。种子培养基g/L葡萄糖 5,酵母膏 5,玉 米浆5,Na2HPO412H2O 0.5,NaH2PO42H2O 0.5,混合维生素 1ml/L,pH 6.5。初筛发酵培养基g/L葡萄糖 20,酵母膏 5,NaCl2 1,MgCl2 2,Na2HPO4 0.5,NaH2PO4 0.5,MgCO3 10,混合维生素 1ml/L。pH 值均调为 6.5。实施例 2将保留的菌株转接于装有 5mL 上述发酵培养基的试管中,37℃厌氧培养 36h。取5mL 培养液转接到装有 80ml 同样发酵培养基的三角瓶中,并补加灭过 菌的碳酸钙,控制 pH6.5,37℃厌氧培养 48h 后,过滤,用 HPLC 法测定上清液 中丁二酸的含量。多数菌株乳酸含量较高,仅有 II-80 号实验室编号为 SW0580 产丁二酸显著。表 1 部分试验菌株的产酸情况实施例 36对筛选的 SW0580 菌株按伯杰氏细菌鉴定手册第八版进行生理生 化特性鉴定见表 2,并按精编分子生物学实验指南的方法提取染色体 DNA, 以 Y1 和 Y2 为正向和反向引物Y1ATTGAACGCTGGCGGCAGGC,Y2 CGGGCGGTGTGTACAAGGCC,用 PCR 扩增 16S rRNA 基因,委托上海申能 博生物科技有限公司进行 16S rDNA 测序,得到本菌株部分 16S rRNA 基因片断 后,在 NCBI 网站上用 BLAST 检索 GenBank 中相关菌株的16S rRNA 基因序列, 并进行同源性比对表 3。基于 16S rDNA 序列分析和生理生化特性鉴定,结 合对该菌的生长和发酵特性进行研究,与最接近或同源性最高的菌株 Actinobacillus succinogenes ATCC 55618 比较,其生理生化特性中利用柠檬酸盐、 H2S 反应、色氨酸吲哚有不同,因此认为是琥珀酸放线杆菌的变种,拟命名 为琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenesSW0580,此菌株已保存在中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为 CGMCC No.1593。表 2 生理生化特性鉴定结果对照表CGMCC 1593 菌株的 16S rDNA 序列1289bpCGGTAACGGG TGGAAAGCTT GCTTTCCATG CTGACGAGTG GCGGACGGGT GAGTAATGCT 60TGGGGATCTG GCTTATGGAG GGGGATAACG ACGGGAAACT GTCGCTAATA CCGCGTAATG 120TCTAAGGACT AAAGGGTGGG ATTTTCGGAC CGCCCGCCAT AAGATGAGCC CAAGTGGGAT 180TAGGTAGTTG GTGGGGTAAA GGCCTACCAA GCCGACGATC TCTAGCTGGT CTGAGAGGAT 240GACCAGCCAC ACTGGAACTG AGACACGGTC CAGACTCCTA CGGGAGGCAG CAGTGGGGAA 300TATTGCGCAA TGGGGGCAAC CCTGACGCAG CCATGCCGCG TGAATGAAGA AGGCCTTCGG 360GTTGTAAAGT TCTTTCGGTG GTGAGGAAGG CGGATAAGTT AACAGCTTAT TCGATTGACG 420TTAGCCACAG AAGAAGCACC GGCTAACTCC GTGCCAGCAG CCGCGGTAAT ACGGAGGGTG 480CGAGCGTTAA TCGGAATAAC TGGGCGTAAA GGGCACGCAG GCGGCTATTT AAGTGAGATG 540TGAAATCCCC GGGCTTAACC TGGGAACTGC ATTTCAGACT GGGTAGCTAG AGTACTTTAG 600GGAGGGGTAG AATTCCACGT GTAGCGGTGA AATGCGTAGA GATGTGGAGG AATACCGAAG 660GCGAAGGCAG CCCCTTGGGA ACGTACTGAC GCTCATGTGC GAAAGCGTGG GGAGCAAACA 720GGATTAGATA CCCTGGTAGF CCACGCTGTA AACGCTGTCG ATTTGGGGAT TGGGCGATAA 780GCCTGGTGCC CGAAGCTAAC GTGATAAATC GACCGCCTGG GGAGTACGGC CGCAAGGTTA 840AAACTCAAAT GAATTGACGG GGGCCCGCAC AAGCGGTGGA GCATGTGGTT TAATTCGATG 900CAACGCGAAG AACCTTACCT ACTCTTGACA TCCTCAGAAT CCGGTAGAGA TATCGGAGTG 960CCTTCGGGAA CTGAGAGACA GGTGCTGCAT GGCTGTCGTC AGCTCGTGTT GTGAAATGTT 1020GGGTTAAGTC CCGCAACGAG CGCAACCCTT ATCCTTTGTT GCCAGCATGT AGAGATGGGA 1080ACTCAAAGGA GACTGCCGGT GATAAACCGG AGGAAGGTGG GGATGACGTC AAGTCATCAT 1140GGCCCTTACG AGTAGGGCTA CACACGTGCT ACAATGGCGT ATACAGAGGG AAACGAGCCC 1200GCGAGGGGGA GTGAATCTCA GAAAGTGCGT CGTAGTCCGG ATTGGAGTCT GCAACTCGAC 1260TCCATGAAGT CGGAATCGCT AGTAATCGC 1289其中,组成为 A25.7%;C21.3%;G32.6%;T20.4%;表 3 16SrDNA 序列同源性或相似性比较实施例 4将 CGMCC No.1593 接种到含不同葡萄糖浓度的上述发酵培养基中,发酵培 养基组成为糖质原料 20-100g/L,氮源 1-50g/L,酵母膏 5-25g/L,Na2HPO412H2O 1.0-5.0g/L,NaH2PO42H2O 1.0-5.0g/L,NaCl 1.0-5.0g/L,MgCl2 0.1-5.0g/L,CaCl2 0.1-5.0g/L,乙酸钠 0.1-5.0g/L,生物素 1-5ml/L,混合维生素 1-10ml/L,培养基 pH3~8;所述混合维生素组成为B12 5mg,B6 100mg,叶酸 20mg,核黄素 20mg, 硫胺素 20mg,烟酸 20mg,泛酸 50mg,对氨基苯甲酸 50mg,蒸馏水定容至 1000ml。控制pH6.5,在充满 CO2 或 N2 的环境中 37℃静止培养 2-4 天,用 HPLC 测定发酵液中丁二酸的含量。当葡糖糖浓度为 60g/L 时,发酵 4 天时发酵液中丁二酸的浓度达到 25.81g/L。 当葡糖糖浓度为 80g/L 时,发酵 4 天时发酵液中丁二酸的浓度达到 32g/L。7实施例 5将 60g/L 乳糖、或蔗糖、或麦芽糖代替上述发酵培养基中的葡萄糖,并接入 培养好的 CGMCC No.1593 种子,用 2mol/L Na2CO3 调节发酵液 pH 维持在 6.5, 按上述的条件进行发酵,发酵 4 天测定发酵液中的丁二酸及杂酸。结果如表 4表 4CGMCC No.1593 菌株对不同糖的发酵产酸实施例 6将木薯或玉米磨粉,过 40 目筛,取木薯粉或玉米粉 200g,加 1L 水调和, 加 1ml液化酶杰能科公司,无锡搅匀,100℃保温 1h。用木薯和玉米粉水解 糖代替上述发酵培养基中的葡糖糖含还原糖 60g/L,接入培养好的 CGMCC No.1593,按上述的条件进行发酵,发酵 4 天测定发酵液中的丁二酸及杂酸。结 果如表 5表 5CGMCC 1 No 1593 菌株对木薯和玉米粉水解糖的发酵产酸实施例 7按实施例 6,用木薯粉水解糖作为发酵培养基中的糖源,按含还原糖 20~150g/L配制不同浓度的发酵培养基,接入培养好的 CGMCC 1 No.593,按上 述的条件进行发酵,发酵 4 天后测定发酵液中的丁二酸及杂酸含量因测出的 乳酸含量都低于 1g/L,所以表中未显示。结果如表 6表 6CGMCC No.1593 菌株对不同浓度木薯粉水解糖的发酵产酸8说 明 书 附 图

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